背景:伴随着肥胖和2型糖尿病的流行趋势,NAFLD现已在全球发展成为最常见的慢性肝病,患病率逐年攀升。目前,约有1/4的普通成人患有NAFLD,且不断呈低龄化趋势。NAFLD具有自身的特定组织学特征,以及肝脏疾病的进展风险,能够导致肝炎、失代偿肝硬化、肝纤维化,甚至发展为肝细胞癌等。NAFLD带来的临床负担,对患者健康的危害以及造成的经济压力仍在不断增加。因此,寻找缓解NAFLD的方法在当代医学领域尤为重要。硫化氢（Hydrogen sulfide,H₂S）是哺乳动物体内一种重要的气体信号分子,参与调控机体多种生理及病理过程。在脂代谢、心肌细胞损伤、氧化应激反应、炎性反应等过程均有重要的调节作用。通常在哺乳动物体内H₂S以半胱氨酸为底物,在胱硫醚γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase,CSE）、胱硫醚β-合酶（cystathionineβ-synthase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3-mercaptopyruvatesulfurtransferase,3-MST）的催化下产生,具有重要的抗炎作用。新近的大量研究也证实H₂S具有减轻脂质蓄积,缓解细胞损伤等作用。然而H₂S是否能够缓解NAFLD的作用机制鲜有报道。目的:用油酸（oleic acid,OA）诱导人正常肝细胞QSG-7701和L02发生脂肪变,给予高脂饲料喂养C57BL/6小鼠构建非酒精性脂肪肝小鼠模型。研究探讨H₂S对非酒精性脂肪肝是否具有改善作用,以及其作用机制。方法:1体外实验我们用OA来诱导人正常肝细胞QSG-7701和L02,建立细胞损伤模型。本实验分为3组:Control组,OA组,OA+H₂S组。用0.5 mM的OA加入细胞培养基中培养24 h,建立细胞损伤模型后,OA+H₂S组加入100μmol/L的硫氢化钠（NaHS）于细胞培养基中培养24 h,而Control组和OA组分别加入与NaHS等体积的PBS培养24 h。1.1 MTT和CCK-8细胞活力检测活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT为蓝紫色结晶甲臢而沉积在细胞里,二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲臢,酶标仪在490 nm波长处测定OD值,其OD值与细胞活性强弱成正比。WST-8与载体1-Methoxy PMS存在时,能够被脱氢酶还原生成橙黄色甲臜产物,酶标仪在450 nm波长处测定OD值,间接反映细胞的活性强弱。因此,我们用MTT和CCK-8实验来判断H₂S对细胞活力的影响。1.2 EdU细胞增殖检测EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）与胸腺嘧啶核苷结构极为相似,其连有的炔烃基团在DNA复制时期替代胸腺嘧啶（T）进入DNA分子中,基于与Apollo?荧光染料的特异性反应,准确的检测出细胞DNA的复制活性,从而判断H₂S对细胞增殖和细胞分化的影响。1.3细胞活性氧ROS检测ROS（Reactive Oxygen Species）的检测是根据一种本身没有荧光的细胞内活性氧探针DCFH-DA自由进入细胞,被酯酶水解为不能穿透细胞膜的DCFH,使DCFH-DA能够被装载在细胞里。细胞内产生活性氧时,无荧光的DCFH被氧化为强绿色荧光物质DCF,细胞绿色荧光越多,ROS产生就越多。因此,检测DCF绿色荧光的多少,来判断H₂S对细胞内活性氧水平的影响。1.4抗氧化酶检测超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）能够清除超氧化物阴离子及生成过氧化氢（H₂O₂）,其通过黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤的催化反应生成超氧阴离子（O₂-.）,O₂-.还原氮蓝四唑（NBT）为蓝色甲臜,SOD通过清除O₂-.抑制甲臜的生成。因此,检测甲臜蓝色的深浅,能够说明SOD的活性。谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GSH-PX）能够催化H₂O₂分解,特异性作用于还原性谷胱甘肽（GSH）对H₂O₂的反应,GSH-PX的活力与其酶促反应有关,通过检测其酶促反应速度来测定GSH的消耗,得出GSH-PX的活力,GSH与二硫代二硝基苯甲酸反应生成黄色的5-二硫代二硝基苯甲酸阴离子,检测OD值。过氧化氢酶（Micro Catalase,CAT）能够分解H₂O₂,加入钼酸迅速终止该反应,未参与反应的过氧化氢与钼酸铵相互作用生成淡黄色物质,检测其OD值,计算出CAT的活力。本实验采用SOD活性测试盒、GSH-PX活性测试盒和CAT活性测试盒按照说明书进行操作,通过计算分析,判断H₂S对抗氧化酶活性的影响。1.5 Western Blot检测运用Western Blot抗体检测蛋白的方法检测:细胞内源性H₂S合成酶相关蛋白的表达（CBS,CSE,3-MST）;凋亡相关蛋白的表达（Bax,Bcl-2,Bad,Bcl-xl,Cleved caspase-3,Cleved caspase-9,Cleved PARP）;与自噬相关蛋白的表达（LC3,Beclin-1,p62）;与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达（PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR）。2体内实验2.1建立C57BL/6小鼠肝脏损伤模型和分组购得8周龄C57BL/6雄性小鼠,动物房稳定饲养1周后进行分组处理,分为3组:低脂组（LFD）、高脂组（HFD）、硫化氢治疗组（HFD+H₂S）。建模:HFD组和HFD+H₂S组给予高脂饲料喂养小鼠8周,建成非酒精性脂肪肝模型。LFD小鼠给予低脂饲料喂养8周。处理:HFD+H₂S组小鼠每天进行100μM/kg/day的外源性H₂S供体NaHS,连续腹腔注射4周,LFD组和HFD组每天给予与NaHS等体积的生理盐水,同样连续腹腔注射4周。2.2小鼠体重和饮食饮水的测量小鼠分组后,测量第一次体重,以后每周测量一次体重,并记录。在HFD+H₂S组给予H₂S腹腔注射期间,小鼠每周称重,并每24 h称取小鼠的饮食量和饮水量,做好记录。体内实验结束后,对小鼠进行麻醉后从小鼠颈动脉采血,处死小鼠,收集组织,进行冷冻保存或者固定保存。2.3检测小鼠血液生化指标对小鼠全血进行离心,检测血浆内总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的含量,用来评估H₂S对非酒精性脂肪肝是否有缓解作用。2.4检测小鼠肝组织的生化指标取小鼠肝脏组织,剪成小块用匀浆器研磨离心,检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（NEFA）的含量,判断H₂S对小鼠非酒精性脂肪肝的影响。2.5组织学形态观察和分析对小鼠的肝组织进行固定、包埋、切片,用苏木精-伊红染色（HE）,同时孵育抗体Cleved caspase-3、Ki67和Beclin-1,显微镜下观察肝脏组织的损伤和变化,判断H₂S对小鼠非酒精性脂肪肝的影响。结果:1.OA诱导QSG-7701和L02细胞发生脂肪变,并降低细胞中H₂S合成酶CBS,CSE,3-MST的表达水平（P<0.05）。2.H2S降低OA诱导的QSG-7701和L02细胞中活性氧（ROS）的水平,并减轻细胞凋亡。与OA组相比,OA+H₂S组细胞增殖能力显著增强,细胞活力水平明显提升（P<0.05）。3.用Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达结果显示:与OA组相比,OA+H₂S组的Bax/Bcl-2,Bad/Bcl-xl,Cleved caspase-3,Cleved caspase-9和Cleved PARP表达明显降低（P<0.05）。4.用Western Blot检测PI3K/AKT/mTOR细胞信号通路相关蛋白的表达结果显示:OA组p-PI3K,p-AKT和p-mTOR的蛋白表达量均升高;与OA组相比,OA+H₂S组的表达量明显降低（P<0.05）。5.检测自噬相关蛋白的表达结果表明:在OA组的LC3A/LC3B和Beclin-1蛋白表达明显降低,p62蛋白表达显著升高;与OA组相比,OA+H₂S组LC3A/LC3B,Beclin-1蛋白表达明显增高,p62蛋白表达显著降低（P<0.05）。6.动物实验结果显示:H₂S降低小鼠肝脏组织中TG,TC和NEFA的含量;同时也降低血浆中TG,TC,ALT和AST的含量。7.组织学上,免疫组化Cleved caspase-3,Ki37和Beclin-1结果显示:与HFD组相比,HFD+H₂S组肝脏组织增殖能力明显增强,自噬水平显著升高,并抑制凋亡水平（P<0.05）。结论:1.OA能诱导人正常肝细胞发生脂肪变,并降低细胞中H₂S合成酶CSE,CBS和3-MST的表达水平2.OA诱导后,H₂S能明显增强脂肪变细胞的活力和细胞增殖能力3.OA诱导后,H₂S能显著抑制脂肪变细胞的凋亡水平4.H₂S通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞凋亡5.H₂S通过增强自噬作用改善非酒精性脂肪肝