癌症的致命性在于它有很强的转移/侵袭性,肿瘤从增殖到转移是一个突变的过程,因此找出肿瘤维持准稳态和突变的关键因素非常重要。为了更加清楚癌症的转移机理,研究人员通过基因测序,基因敲除,荧光蛋白标记,蛋白表达量测试等方法进行研究。相比传统的细胞二维培养方法,越来越多的动物模型和细胞体外三维培养作为研究手段,其中肿瘤多细胞球就是癌症研究中广泛使用的体外三维培养模型。从形态学角度看,癌细胞球在发生侵袭时边缘会出现很多分支,这会释发出很多异常的信号。为了在很短的时间内准确地抓住这些异常的信号,我们使用三种不同的癌细胞球模型进行实验,用自制的活细胞装置进行体外实时追踪,建立了一套自动化定量分析癌细胞形态参数变化的方法,找出癌细胞从保持准稳态到突变发生的临界点。我们将这种方法应用于多种肿瘤球体模型,证明其作为评估生长—侵袭转变时间和比较肿瘤细胞侵袭潜力,并提供极好的参考能力,这使得我们的定量方法可用于癌症转移研究和临床诊断领域。主要工作包括以下三个方面:(1)活细胞装置的搭建:搭建了一套用于活细胞体外成像的微环境控制系统,包括培养微腔室和控制系统两个部分。培养微腔室用于给细胞生长提供良好环境,如温度,湿度,二氧化碳浓度等参数;控制系统用于对培养微腔室盖子、基体、水浴加热的温度控制、物镜镜头加热的温度控制和二氧化碳浓度控制。该套装置成本消耗低,能够很好地为癌细胞球提供生长微环境。(2)U87、H1299、MDA-MB-231癌细胞球的成球和侵袭实验:肿瘤多细胞球体用于模拟正常和实体肿瘤组织的器官型模型。用于产生癌细胞球的传统技术,例如,微流体芯片法、旋转瓶法,微图案板法,超低附着板法,悬滴法等等,每一种方法都有各自的优势和缺点。在本研究中采用了是超低附着板法进行成球实验。1.0×10~4 cells/mL的细胞密度被接种到96孔超低吸附圆底板中。然后放置在培养箱中培养4天。4天后,形成了紧实,大小均一的球体。然后将癌细胞球从96孔超低吸附圆底板中吸出重新注入到96孔超低吸附平底板中,并加入含有2.0 mg/mL胶原蛋白的培养基中进行侵袭实验。(3)癌细胞球的形态学多参数定量分析:肿瘤致命性关键在于肿瘤转移,这是肿瘤向癌症转变的转折点。本研究创新地以物理学中稳态转变(或相转变)临界行为作类比,创立肿瘤细胞群发生侵袭临界点的量化标准,从而研究其触发条件及机制。我们建立了4种形态学参数来定量化分析癌细胞球发生侵袭的临界点,以此为突破找到抑制肿瘤转移的方法。该套方法可以为肿瘤/癌症的诊疗提供崭新的思路和方案,减少或延缓癌症病人的死亡。