【摘 要】
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目的:新生儿坏死性小肠结肠炎(neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是引起早产儿死亡的严重事件,目前尚无有效治疗方法改变其结局,关键在于“预防”。本研究在前期研究的基础上,利用NEC动物模型,探讨乳凝集素(MFG-E8)在维护肠道屏障完整性和促进肠上皮细胞极性生成及损伤修复的具体作用机制,为寻找母乳中有效成分预防NEC提供新的靶点。方法:1.制备新生大鼠NE
【基金项目】
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国家自然科学基金委(81742072); 上海市科学技术委员会(124119a5600);
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目的:新生儿坏死性小肠结肠炎(neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是引起早产儿死亡的严重事件,目前尚无有效治疗方法改变其结局,关键在于“预防”。本研究在前期研究的基础上,利用NEC动物模型,探讨乳凝集素(MFG-E8)在维护肠道屏障完整性和促进肠上皮细胞极性生成及损伤修复的具体作用机制,为寻找母乳中有效成分预防NEC提供新的靶点。方法:1.制备新生大鼠NEC模型,采用外源性乳凝集素干预,观察各组新生大鼠临床表现、NEC病情及死亡率变化情况,并进行小肠组织切片HE染色病理组织学评分,透射电镜检测小肠上皮屏障通透性的变化。应用real-time PCR、western blot和免疫荧光技术检测小肠上皮细胞连接蛋白的表达水平及分布情况,CO-IP免疫沉淀方法分析连接蛋白之间的相互作用。通过全转录组基因测序方法分析与紧密连接蛋白相关基因的表达差异,构建基因表达网络,筛选乳凝集素作用的可能通路。2.预防性给予NEC模型MFG-E8及其N端结构域多肽干预,观察NEC发生率、病情及肠道损伤的变化,检测小肠组织中碱性磷酸酶的活性。应用real-time PCR、western blot和免疫荧光方法检测极性蛋白PAR3的表达分布。采用LPS干预大鼠小肠上皮细胞,体外构建细胞炎性模型。划痕实验观察肠上皮细胞损伤迁移速率的变化。进一步检测小肠中细胞极性形成关键调节子EGFR的表达及分布情况。添加EGFR抑制剂Erlotinib,阻断EGFR受体后,观察各实验组肠上皮细胞EGFR的磷酸化比例以及下游Akt信号的活化程度。通过全转录组基因测序方法分析相应基因的表达差异,根据TPM值分析相关信号通路调节蛋白的表达,预测影响肠上皮细胞迁移的可能信号通路。结果:1.喂养添加乳凝集素配方奶的新生大鼠NEC发生率及病死率较单纯配方奶组明显下降,病程缩短,病理组织学评分下降,肠道炎症损伤较轻,肠上皮通透性降低,细胞间连接紧密,缝隙缩小。乳凝集素处理组肠上皮细胞内连接蛋白ZO-1,claudin 3,JAM-A以及粘附连接蛋白E-cadherin的表达水平升高,并被募集、锚定在正常功能位置。连接蛋白ZO-1与occludin之间相互结合,形成紧密连接复合物。转录组基因表达分析发现乳凝集素能上调细胞连接形成的重要信号分子Cdc42表达水平。2.预防性给予新生大鼠乳凝集素及其N端结构域后,NEC的发生率及病死率较未干预组明显降低,碱性磷酸酶活性增高,极性蛋白PAR3表达增高,并分布于肠上皮细胞膜上。划痕实验显示,乳凝集素干预组肠上皮细胞向损伤部位迁移速率加快,肠上皮细胞表面EGFR表达升高,同时EGFR磷酸化水平及下游Akt活化率上调,EGFR-Akt信号通路被激活。全转录组基因测序发现,乳凝集素干预后EGFR通路中影响细胞骨架形成的Vav信号蛋白水平上调,促进损伤修复。结论:1.乳凝集素可以降低NEC病死率,改善肠道的损伤程度,具有防治NEC发生及发展的作用。2.乳凝集素能够上调细胞连接蛋白ZO-1、claudin 3、JAM-A和E-cadherin的表达,锚定其位于正常功能位,促进ZO-1、occludin之间相互作用,组装形成AJC,维持肠道上皮细胞连接的稳定,发挥保护肠道屏障完整性的作用。Cdc42信号分子可能是乳凝集素改善肠上皮细胞间连接蛋白形成的作用靶点之一。3.乳凝集素可能通过作用于肠道上皮细胞表面的EGFR受体,活化下游Akt信号,影响极性蛋白PAR3的表达及分布,进一步促使肠道上皮细胞的极性形成,恢复有序的极性排列,使相邻细胞间连接蛋白形成有效连接,促进肠上皮细胞损伤修复,维持肠道功能稳态。
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