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疯草是豆科棘豆属（Oxytropis）和黄芪属（Astragalus）有毒植物的总称,是世界范围内危害草原畜牧业可持续发展的主要毒草。我国拥有天然草原面积4亿hm~2,毒草危害面积约3330万hm~2,其中疯草毒性灾害最为严重,约占毒草危害面积的33%。其主要毒性成分为吲哚里西啶生物碱—苦马豆素（swainsonine,SW）。SW的化学结构与动物体内甘露糖高度相似,与甘露糖苷酶有极高亲和力,能够竞争性抑制Ⅱ类α-甘露糖苷酶活性,导致糖代谢紊乱,进而出现以广泛组织细胞空泡变性为主要特征的疯草中毒病。自噬是真核细胞自我保护的代谢途径,通过将受损细胞器、大分子物质等与部分细胞质包裹形成自噬体,而后与溶酶体等结合形成自噬溶酶体,并对包裹内容物进行降解与回收,实现物质与细胞器的更新,维持胞内物质与能量供给的平衡。研究表明,当出现自噬障碍时,细胞会呈现空泡样病变,但细胞自噬对于SW致空泡变性中的作用及其机制尚不清楚。鉴于此,本研究以小鼠海马神经元细胞（Mouse Hippocampal Neurons cell line,HT22）为试验细胞模型,开展相关研究,并得出以下研究结果:1.苦马豆素造成HT22细胞损伤SW处理后,倒置相差显微镜观察HT22细胞内空泡变性情况,发现随着处理剂量和处理时间的延长,空泡变性逐渐加重;qRT-PCR检测高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ和溶酶体α-甘露糖苷酶表达量变化,发现它们的表达量随着处理剂量和处理时间的延长,基因表达量显著下调,巴弗洛霉素A1能够改善以上两种情况,减缓SW的毒性。2.苦马豆素诱导HT22细胞发生自噬自噬标志物LC3蛋白及基因的表达。用不同浓度SW培养液处理细胞12 h,LC3-Ⅱ/β-actin以剂量依赖性方式增加,mRNA表达也有相同变化,且组间差异有统计学意义。随后用0.8 mg/mL的SW处理细胞不同时间,LC3-Ⅱ/β-actin也以时间依赖性方式增加,mRNA表达变化相同,且各时间点与对照组之间差异均有统计学意义。荧光染色。用不同浓度SW培养液处理细胞12 h,对照组细胞MDC染色呈弥漫性,而处理组细胞出现荧光聚点,表明出现广泛的MDC阳性自噬泡。LC3-Ⅱ荧光染色结果显示,SW增加了HT22细胞中LC3-Ⅱ荧光聚点的形成,且荧光强度随剂量升高而增强。用0.8 mg/mL的SW处理不同时间,MDC阳性自噬泡和LC3-Ⅱ斑点呈现明显增加。通过透射电子显微镜观察,随着SW浓度增加和处理时间的延长,发现细胞内自噬泡数量明显增多。上述结果表明,SW可诱导HT22细胞产生大量的自噬体,且具有明显的剂量效应和时间效应。3.苦马豆素激活自噬并导致自噬降解受阻试验发现ATG5、Beclin1和p62蛋白及其mRNA表达水平随着剂量和时间的增加而增加。ATG5和Beclin1的升高,显示自噬体增多,表明细胞内自噬水平升高,p62的积累表明自噬的最终降解受阻。而自噬降解受阻有两种可能,一是溶酶体的功能受损,二是自噬体与溶酶体融合发生障碍。因此,通过Western-blot和qRT-PCR检测了溶酶体膜相关蛋白1（lysosomal membrane-associated protein 1,Lamp1）在SW不同浓度和时间处理后的变化,显示Lamp1蛋白及其mRNA表达变化呈升高趋势,且有明显时间和剂量效应;随后,使用Lyso Sensor?Green DND-189和Lyso-Tracker Red对溶酶体进行染色观察,发现随着攻毒剂量的增强,溶酶体数量增多,但腔内的pH升高。表明SW处理后细胞内自噬降解受阻与溶酶体功能受损有关。4.mTOR相关通路参与调控苦马豆素诱导的HT22细胞自噬采用Westermn-blot检测自噬信号mTOR相关通路蛋白的表达。用不同浓度SW处理HT22细胞,随着SW浓度的增加,p-PI3K、p-AKT、p-ERK、p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K和p-4EBP1蛋白表达水平显著下降,总的PI3K、AKT、ERK、AMPK、mTOR、p70S6K和4EBP1保持不变,p53蛋白表达水平显著升高。研究结果表明,PI3K/AKT/mTOR、ERK/mTOR和p53/mTOR自噬信号通路参与SW诱导的HT22细胞自噬调控,而AMPK/mTOR通路不参与该调控。由上述试验结果可以看出,SW通过损伤HT22细胞溶酶体功能,导致细胞内自噬体不能被完全降解,而诱导HT22细胞自噬的发生;进一步研究发现在SW诱导的HT22细胞自噬中,PI3K/AKT/mTOR和ERK/mTOR信号通路发挥正向调控作用,p53/mTOR信号通路起负向调控作用,而AMPK/mTOR信号通路不参与该调控过程。本试验结果可为进一步揭示SW毒性作用机制及疯草中毒病防治提供重要理论依据。