蓝光和真菌诱导对竹红菌素生产的调节作用研究

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竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Heen)是主要寄生于短穗竹属(Brachystachyum)等竹子上的病原真菌,其子实体-竹黄是我国传统的中药材。竹黄中的竹红菌甲素(hypocerllin A,HA)作为一种具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性的新型非卟啉类的天然光敏剂,在光化学疗法(photodynamic therapy,PDT)上具有较高的应用潜力。由于野生竹黄资源有限,通过菌丝培养的方式生产竹红菌素的产量又较低。本研究通过两种不同的诱导处理:蓝光培养和伴生真菌刺激,探讨非生物与生物诱导对竹黄菌的生长和竹红菌素合成的影响,优化最佳诱导条件,并进一步探究竹红菌素合成的调节机制,为竹红菌素的生物技术生产提供了新型诱导技术,为竹黄菌次生代谢的调控机制提供基础和参考,主要研究如下:1.通过筛选竹黄菌菌丝培养中的光照条件(蓝光强度和处理时间),发现持续蓝光可以显著抑制竹黄菌中HA的合成,促进HA合成的最佳诱导条件为:菌丝培养期间,每日200 lx光照6 h,可使HA总产量达到204.38 mg/L,是对照组的2.02倍。同时,蓝光处理对竹黄菌发酵液的pH并无显著影响,持续蓝光条件下发酵液残糖降低,而间歇蓝光处理(6 h/day)对发酵液残糖量没有显著影响。2.蓝光能够促进竹黄菌孢子的萌发和生长,同时显著促进了孢子产生,且这种促进作用随光照时间延长而增强。处理后竹黄菌菌丝表面变得粗糙,末端开始膨大分节,颜色加深。菌团表面菌丝变得粗糙蓬松,持续蓝光条件下几乎无色素积累,间歇蓝光处理(6h/day)使得色素积累明显增多。3.对竹黄菌固体培养的菌丝进行活性氧特异性荧光染色观察,持续蓝光照射后,菌丝中活性氧的积累减少,间歇蓝光处理(6h/day)的竹黄菌菌丝中则有大量的活性氧积累。而液态培养的竹黄菌在受蓝光作用(持续蓝光和每日6h)后H2O2的含量明显提高,这表明竹黄菌在蓝光条件下培养能够诱导菌丝中活性氧的产生。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的酶活性在间歇蓝光处理(6h/day)的条件下没有明显变化,在持续蓝光条件下则明显增高。这表明蓝光条件诱导了竹黄菌的活性氧迸发并使真菌处于氧化胁迫中。4.持续蓝光条件下与HA合成相关的基因(PKS、FAD、Mono、ZFTF等)表达水平下调,蓝光处理6 h的条件下与HA合成相关的基因(PKS、FAD、Mono、MFS等)表达水平则上调,表明蓝光在生理水平上影响HA的合成。此外,蓝光对HA具有一定的降解作用,影响了 HA的产量。5.本研究从野生的竹黄子实体中分离得到34株真菌,包括6株竹黄菌和28株伴生真菌,分别属于2门,6纲,11目,15科和19属。结合高通量测序技术对竹黄子实体伴生真菌进行了多样性分析。34株真菌中25株(73.5%)为子囊菌门:竹黄属6株,约占总数的26.5%;节菱孢属4株,约占11.8%。9株为担子菌门,均属于伞菌纲:平革菌属3株,约占8.82%,栓菌属2株,约占5.88%。6.伴生真菌-镰刀茵(Fusarium sp.SF12)与竹黄菌共培能够显著提高HA的合成。经过对SF12真菌不同部位或成分、加入浓度、加入时间的筛选,确定了最佳诱导条件为:在竹黄菌培养的第1天加入终浓度为100个/mL的真菌SF12孢子。在此条件下,既促进了竹黄菌胞内HA的合成,也促进了 HA向胞外的分泌,使HA的总产量达到209.46 mg/L,是单培养对照组的1.93倍。7.竹黄菌生理生化指标的检测结果表明伴生真菌诱导子的加入对竹黄菌发酵液的pH和残糖没有显著影响。SF12孢子加入后与HA合成相关的基因(FAD、PKS、MFS、Mono等)表达水平下调,表明伴生真菌诱导子与竹黄菌共培可以通过基因转录水平影响HA的合成。本研究探讨了蓝光和子实体伴生真菌对竹黄菌生长和竹红菌素合成的影响,通过条件优化获得了最佳诱导条件,结合形态变化、氧化还原态势、基因表达变化等方面探讨了两种诱导处理对HA生物合成的影响机制,得到了有效提高竹红菌素产量的蓝光培养和真菌共培方法,为后续竹黄菌的大规模培养发酵和HA的生产提供了理论和应用基础。
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