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背景TGF-β/SMAD信号通路作为一种肿瘤抑制信号,在多种实体瘤中有降低或者异常表达,在白血病中也有异常表达。TGF-β/SMAD信号通路中的组分突变失活或者其下游靶基因的表达失调可导致TGF-β/SMAD信号通路受阻,白血病细胞异常增殖,分化受阻。大量的证据表明,TGF-β/SMAD信号通路在TGF-β、维生素D及全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化过程中发挥了关键的作用。此外,上游的多种转录因子也可以调节TGF-β/SMAD信号通路的转导,如早期生长反应因子1(Early growth response factor1,Egr-1)和Wilms肿瘤基因1(The Wilms’ tumour1,WT1))等。另外,有文献报道,Egr-1和WT1编码的蛋白的结构中均含有相似的锌指结构域,二者具有广泛的同源性。这些因子编码的的蛋白与TGF-β1的启动子区域有相应的结合位点,通过结合到靶基因上相应的DNA结合区域来调控其转录。P21是位于P53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子,主要发挥抑癌的作用。研究表明:P21与肿瘤的分化有密切的关系。在白血病细胞中,P21处于低表达的水平,可能与其在转录及翻译后水平的表达调控异常有关。根据文献报道,TGF-β可以介导P21的表达。血管内皮生长因子VEGF(Vascular endothelial growth factor)作为一种重要的促肿瘤血管生成因子,对造血微环境稳态的破坏可能导致了白血病等恶性血液病的发生。在体外实验中,VEGF促进白血病细胞的增殖,抑制其凋亡。根据文献中的报道,P21抑癌基因作为TGF-β/SMAD信号通路的靶点之一,与造血干细胞的自我更新有关,另外SMAD3蛋白可以特异性的结合到VEGF启动子区域(1006-954bp),从而负向调控VEGF转录。P21和VEGF均为TGF-β/SMAD信号通路下游的相关的靶基因,信号通过的变化必定会引起P21和VEGF的表达变化。在以上背景材料下,我们的实验以TGF-β/SMAD信号通路为切入点,设计了相关的不同的实验,来研究在不同类型白血病细胞向单核/巨噬细胞分化过程中,Egr-1和WT1对TGF-β1的调控作用及其对TGF-β/SMAD信号通路信号传递的影响。目的以TGF-β/SMAD信号通路作为研究的切入点,探讨佛波酯(PMA)诱导白血病细胞向单核-巨噬细胞方向分化后转化生长因子TGF-β1及其下游转录因子早期生长反应因子-1(Egr-1)和Wilms肿瘤基因1(WT1)的表达变化和TGF-β/SMAD信号通路的转导情况,进一步探讨Egr-1和WT1是否可以通过调控TGF-β1来影响TGF-β/SMAD信号通路。方法建立PMA诱导K562、HL-60、THP-1的白血病细胞分化的体外模型,采用CCK8法检测不同的PMA的浓度在作用不同时间后对K562细胞的增殖的影响,并计算PMA作用于K562细胞72h后的半数抑制浓度(IC50),应用Wright-Gimesa染色观察药物作用于各白血病细胞之后形态学上的变化,运用流式细胞术检测细胞分化抗原CD11b、CD14的表达变化,并进行半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Egr-1、WT1及TGF-β/SMAD信号通路中相关因子如TGF-β1、SMAD3、SMAD4以及信号通路下游基因P21和VEGF在基因水平的相对表达趋势,同时用Western blot的方法检测Egr-1、WT1和TGF-β1在蛋白水平的相对表达情况,用染色质免疫共沉淀实验(CHIP)验证Egr-1、WT1在药物作用前后与TGF-β1的结合情况。结果不同浓度的PMA能抑制K562细胞的增殖并能促进其分化,通过计算得出PMA作用的半数抑制浓度(IC50)约为100nm/L;在光学显微镜下观察细胞形态学的变化,均出现相似的变化,细胞由悬浮状态逐渐变为贴壁生长,细胞的体积明显增大,细胞胞质的褶皱增多,核质比减少,呈现出向成熟的单核-巨噬细胞方向分化的趋势;细胞表面分化抗原CD11b、CD14的表达量升高;在mRNA水平,TGF-β/SMAD信号通路中TGF-β、 SMAD3、SMAD4的表达呈上升趋势。在mRNA和蛋白水平,WT1的表达量呈现降低的趋势,而Egr-1的表达先升高后降低,;信号通路下游基因的靶基因P21的表达量升高,而VEGF的表达量较对照组降低;CHIP实验说明在正常的白血病细胞中Egr-1与TGF-β1的启动子区域之间不结合,WT1结合于TGF-β1的启动子某一区域;而PMA作用于白血病细胞之后,Egr-1和WT1与TGF-β1启动子的结合出现逆反,即药物作用促使Egr-1结合于TGF-β1的启动子区域,而抑制了WT1与TGF-β1启动子某一位点的结合。结论在体外,PMA可以抑制白血病细胞系K562细胞的增殖。PMA作用于各白血病细胞后,细胞呈现出向成熟的单核-巨噬细胞方向分化的趋势,说明PMA具有较强的诱导K562细胞向单核-巨噬细胞系分化的作用,在此分化过程中,Egr-1可能是通过结合到TGF-β1的启动子区域,从而抑制了WT1蛋白与TGF-β1的结合,从而使TGF-β/SMAD的信号通路得到部分恢复,发挥了促进白血病分化的作用。