目的:土槿皮是我国的一种传统中药,土槿乙酸(pseudorlaric acid-B)是其主要的活性成分。近年来研究发现土槿乙酸及其衍生物具有较强的抗肿瘤活性。本实验室将土槿乙酸单体进行相应的化学结构改造,得到多种土槿乙酸衍生物,发现其中PB-LY在体外有较强的抗肿瘤活性,且具有良好的量效关系。本课题进一步研究PB-LY对体外培养的肿瘤细胞和动物移植性肿瘤的抑制作用和特点,并初步探讨其作用机制。方法和结果:1 PB-LY的体外抗肿瘤作用本课题通过体外MTT法发现PB-LY对多种肿瘤细胞都有较强的抑制作用,其IC50在1.35μmol/L～5.98μmol/L之间。通过SRB结果显示,PB-LY主要是通过抑制肿瘤细胞生长而起到抗癌作用,对Hela的GI50为0.94μmol/L,但LC50要达到10.21μmol/L。在不同浓度的PB-LY作用下,通过观察对Hela、SKOV3细胞生长曲线的影响,发现肿瘤细胞的增殖活性明显减弱且具有量效关系。2 PB-LY的体内抗肿瘤作用体内移植肿瘤实验亦观察到PB-LY对小鼠实体型肉瘤S180有一定的治疗作用。连续给昆明小鼠腹腔注射PB-LY(40mg/kg/d及80mg/kg/d)10天,对小鼠S180肉瘤的生长抑制率分别为13.5%和36.5%,大剂量与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),说明PB-LY在体内试验表现出良好的抗肿瘤作用。3 PB-LY对肿瘤细胞周期的影响本文采用流式细胞仪检测不同浓度(0.5~4.0μmol/L)的PB-LY作用12h、24h和36h后对Hela细胞的影响。结果显示与空白对照组相比PB-LY可使G1期的Hela细胞比例明显减少,使细胞的周期阻断在G2+M期。4 PB-LY诱导肿瘤细胞的凋亡不同浓度的PB-LY(0.5～2.0μmol/L)作用于Hela细胞24小时后,用荧光染料Hoechst 33342对细胞进行染色,在紫外光激发下发蓝色荧光,荧光显微镜下观察可发现Hela细胞凋亡的形态学变化。并且随着PB-LY浓度的增加,细胞凋亡形态的变化愈显著,凋亡细胞的比例逐渐增多,具有剂量依赖性。在经典的DNA降解断裂检测实验中,经不同浓度的PB-LY(0.5～4.0μmol/L)作用于Hela和SKOV3细胞24小时后,抽提富集小分子量DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现典型的“DNA梯子”(DNA ladder)。通过流式细胞仪对细胞的DNA含量进行测定,可见经不同浓度的PB-LY(0.5～4.0μmol/L)作用于Hela细胞24小时后,对细胞DNA进行荧光染色,于正常G0/G1细胞群前出现DNA低染细胞群,称为“A0细胞群”或“亚G1细胞群,Sub- G1”即凋亡细胞群,该现象被认为是细胞发生凋亡的标志之一,且凋亡细胞的比例随着PB-LY浓度的升高而增大,呈一定的剂量依赖性。综上结果可以认为PB-LY能够诱导肿瘤细胞的凋亡。5 PB-LY对肿瘤细胞凋亡相关基因P53、P21、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表达的影响本文观察了PB-LY对Hela细胞凋亡相关基因P53、P21、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表达的影响。RT-PCR结果显示0.5μmol/L~2.0μmol/L PB-LY能增加Hela细胞中P53, Caspase-3和Bax的mRNA的表达,同时降低了P21和Bcl-2的mRNA的表达,同对照组相比均有显著性差异。提示PB-LY诱导肿瘤细胞凋亡的作用是依靠上调了Caspase-3 , P53和Bax mRNA的表达,同时协同下调抑制凋亡基因P21和Bcl-2的表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。结论:PB-LY在体内外均具有明显的抗肿瘤作用,能显著的抑制肿瘤细胞的生长,并且可将肿瘤细胞阻断在G2+M期,同时影响肿瘤细胞内相关癌基因及抑癌基因P53、P21、Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA的表达。从而诱导肿瘤细胞的凋亡。因此PB-LY有望成为一个以天然产物土槿乙酸为先导化合物,经衍生后得到的新抗癌化合物。