精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)位于雄性哺乳动物体内曲精细管生精上皮基膜内,紧贴生精上皮基膜,圆形或椭圆形,直径约12μm,胞质内除核糖体外,细胞器不发达。精原细胞分A、B两型,A型细胞中未分化的精原细胞又可分为单个型A-single (As)、对称型A-paired (Apr)及链状排列型A-aligned (Aal)三型,As型精原细胞是精子发生的干细胞即SSCs,经过不断地分裂增殖,一部分A型精原细胞继续作为干细胞;另一部分分化为B型精原细胞,经过数次分裂后,分化为初级精母细胞,再继续进行减数分裂形成精子。因此SSCs具有其它类型的成体干细胞所不具备的特点,即它是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞,能定向分化为各个阶段的生精细胞直至精子,向下一代传递遗传信息,同时又是雄性成体内惟一可复制的二倍体的“永生细胞”。已有诸多研究对SSCs的分离、培养、增殖以及分化进行了研究。而利用SSCs作为中间载体细胞制作转基因动物已经成为一条新的转基因技术途径被广泛关注和研究。然而SSCs的表面分子特征以及增殖分化调控机制研究尚不深入,迄今为止未获得纯的SSCs群体,也未有成功建系的报道;而在畜牧生产中大型哺乳动物如家畜SSCs的研究更较少见于报道。本研究旨在建立一个利用SSCs作为转基因技术中间载体的基础平台,主要进行五指山小型猪SSCs的分离、培养和分子特征的鉴定,并成功转入GFP基因,为将来进一步开展转基因动物制作打下基础。实验以五指山小型猪为细胞来源材料,选取性成熟前的仔猪从其睾丸组织分离支持细胞(Sertoli cells)制备饲养层,采取两步酶法消化睾丸组织获得单细胞悬液,再经贴壁分选去除杂细胞,从第9天开始在饲养层上形成的克隆样细胞团簇,并可传代后继续增殖,在体外培养最长达两个月,但是传至第5代以上的SSCs丧失其原有形态特征;并发现为在饲养层上体外培养的猪SSCs添加干细胞因子能使其生长更为旺盛;免疫鉴定结果发现五指山小型猪SSCs表达THY-1(CD90)、CD9、intergrinβ-1(CD29)、Gfrα-1以及OCT4等干细胞特征分子,提取SSCs总RNA进行了RT-PCR检测证实SSCs除表达上述基因外还表达SOX2这一干细胞多潜能性标志基因,同时发现实验获得的SSCs不表达c-kit基因,该基因是向精原细胞分化标志,这说明实验中获得的SSCs较好的保持了未分化状态。使用脂质体转染法向SSCs转入EGFP基因获得成功,观察到绿色荧光蛋白表达。虽然未建成真正的SSCs细胞系,但是本研究以斯托利细胞做饲养层维持SSCs体外存活增殖两个月已足以满足开展转基因等研究。对SSCs的分子特征鉴定也为进行高效免疫分选提供参考,将来结合移植技术等开展深入研究,SSCs转基因技术有望成为生产转基因动物和进行动物克隆研究新的途径。