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3’、5’-二叔丁基-4’-甲氧基-4-羧基查尔酮(R9158)是我所研制的第三代维甲类化合物。本文就R9158对癌细胞的分化诱导作用、分子药理学作用特点、作用机制及毒性进行了系统的研究。研究结果表明:R9158对人急性早幼粒白血病HL-60细胞具有明显的分化诱导作用。R9158 10-6mol/L可明显抑制HL-60细胞的生长及克隆形成率,并使成熟分化指标:NBT还原能力明显升高,10-6mol/L作用6天可使NBT阳性细胞数达90%以上。细胞形态向成熟方向分化,镜下可见大量中晚幼粒细胞及一些杆状及分叶核细胞。电镜下细胞膜系统完整、核浆比例变小、胞浆中有特异性颗粒出现。流式细胞分析表明R9158 10-7mol/L处理HL-60细胞48小时就可阻断细胞由G1向S期移行。96小时可使G1期细胞数达78.2%。研究还发现R9158同样可使另一株人急性早幼粒白血病NB4细胞生长抑制,NBT还原能力增强。R9158与RA诱导NB4细胞分化的ED50分别为3.9×10-9及2.8×10-9mol/L。R9158对NB4细胞形态的影响出现较早,诱导2天就可见核缩小,核浆比例变小,但形态分化不完全,10-6mol/L处理6天,大部分细胞仍集中在中幼或晚幼粒阶段,无杆状及分叶核细胞。NB4细胞染色体呈亚四倍体型,染色体数分布在71-99之间,G显带表明它具有明显急性早幼粒白血病(APL)病人的t(15;17)移位特征。给R9158及RA 10-6mol/L处理细胞3-6天后可使染色体非整倍体数目有所下降。从对照细胞的80.85±7.11降至RA:68.5±7.01(P<0.01),R9158 72.96±6.9(P<0.01)。但t(15;17)移位未见消失。R9158对体外培养的人肝癌Bel-7402细胞也有良好分化诱导作用。R9158处理后可使生长抑制,克隆形成率下降。其作用强于RA。R9158及RA10-5mol/L处理Bel7402细胞不同时间,可见肝癌的增殖指标甲胎蛋白(AFP)分泌及γ-谷胺酰转肽酶(γ-GT)活性下降,而肝癌分化指标白蛋白(Alb)分泌明显升高。R915810-6及10-5mol/L处理48小时,形态上就可见核浆比例变小,继续处理可使核明显缩小,核固缩甚至碎裂,胞浆空泡化。但膜系统仍完整。利用[3H]TdR、[3H]Leu前体参入实验发现R9158对Bel-7402细胞DNA及蛋白质的合成均有一定抑制作用,但对蛋白质的抑制作用出现早且作用强,RA与之相比对Bel-7402细胞前体参入的影响较小。R9158对大鼠软骨肉瘤具有非常强的抑制作用,1.2mg/kg给药4次抑制率达99.3%。R9158对维甲类不敏感的动物移植性肿瘤也有一定抗肿瘤作用。其中R91585mg/kg给药3次可使B16黑色素瘤抑制率达58.9%(P<0.01);6mg/kg给药5次对Lewis肺癌的抑制率达65%(P<0.01)。肉瘤S180,R915811.8mg/kg给药3次也可使抑制率达36.5%(P<0.01)。在体外用MTT方法观察了R9158对培养的人卵巢癌A2780,大食管癌CaEs-17,人肝癌Bel-7402,人巨细胞肺癌PLA-801C及PLA-801D,人口腔癌KB及人结肠癌HCT-8等细胞生长的影响。发现R9158对上述细胞作用的ED50均在2-6.45×10-6mol/L范围之间,说明R9158有较强的细胞毒作用,而RA对上述细胞无明显细胞毒作用。以上说明R9158具有较强的抗肿瘤作用。为了研究R9158作用的选择性,我们用MTT法比较了R9158对体外培养的正常细胞的作用。发现R9158对小鼠成纤维Balb/3T3,中国仓鼠肺细胞CHL及人胚肺2BS细胞无明显细胞毒作用。R9158在明显抑制HL-60细胞克隆形成率的剂量下对小鼠骨髓细胞CFU-GM形成影响很小。用淋巴母细胞体外转化实验发现R9158对淋转无抑制作用。这说明R9158对正常组织毒性小,对免疫及造血组织无明显抑制作用,其抗肿瘤作用具有一定选择性。耐药与多药耐药是肿瘤化疗的一大难点。研究发现,R9158对多药耐药细胞KB/VCR 200及HCT-8/VCR 2000与其亲本细胞KB,HCT-8具有同样敏感性。ED50分别为4.36×10-6mol/L与1.05×10-6mol/L,说明R9158与常规化疗药无交叉耐药。R915810-5mol/L处理24小时可使上述耐药细胞中高表达的mdrl多药耐药基因表达下降。但R9158对维甲酸耐药的HL-60/RA及维甲酸不敏感的K562细胞与维甲酸具有交叉抗性。初步的毒性观察结果表明:R9158对小鼠的LD50为118.3mg/kg,大鼠LD50为19.36mg/kg。R9158在治疗剂量下对荷软骨肉瘤的大鼠,除使体重增加较慢外,血常规,肝、肾功能及各脏病理检查均未见异常。狗的初步亚急性实验发现R91583mg/kg,口服15-21天可引起维A类过多症(如脱毛、体重下降等),但对血常规,心电图,肝肾功,在给药前中后无明显变化。病理报告除有肝脏充血,一条雄性狗睾丸曲细精管生精不良外,其它脏器均未见异常。运用基因重组技术研究发现,给维甲类不敏感的人髓样红白血病K562细胞转入维甲酸受体基因hRARα,可大大增加其对RA及R9158的敏感性。用RA或R9158处理可使K562-RARα细胞生长明显抑制,并使血红蛋白(Hb)的生成量增加。这提示R9158的作用机理与RA相似,通过维甲酸受体诱导肿瘤细胞分化。进一步用Dot blot技术研究发现R9158可在转录水平上调控某些基因的表达。R915810-6mol/L作用24小时,先于形态及生长速率变化就可使癌基因c-myc表达明显下降,而c-fos表达增高。在Bel-7402细胞,R915810-5mol/L处理24小时可见c-myc及N-ras癌基因表达下降,而诱导c-fos表达升高。这说明R9158的分子机制与RA相似,直接通过细胞核维甲酸受体,在转录水平上调控参与细胞增殖分化的癌基因,如c-myc,N-ras,c-fos等来完成其癌分化诱导作用。