论文部分内容阅读
本论文研究隶属于科技部十三五国家重点研发计划项目(2018YFD0400300)。蛋白酶可水解蛋白质,生产氨基酸及多肽,广泛应用于食品工业中。在蛋白质酶解的过程中,通常加入较高的底物浓度(2~7%,w/w),以提升设备利用率、降低能源消耗、降低生产成本。研究发现高浓度的底物将使酶解速率降低,近年来,大部分学者都只关注于提升酶解速度的方法探究。实际上高浓度的底物引起“大分子拥挤效应”,从大分子拥挤角度探究酶解规律变化及酶活性发挥的研究报道尚少。本文以蛋白酶为研究对象,探究了大分子拥挤试剂Ficoll 70对芽孢杆菌属蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶活性发挥及水解规律的影响,并采用内源性荧光光谱、圆二色谱和分子动力学模拟的方法,探究大分子拥挤对蛋白酶结构的影响;同时设计出细胞膜内表面大分子拥挤的传感器,使细胞膜内表面大分子拥挤环境的量化实现可能。本论文的主要内容与结果如下:1.考察了Ficoll 70对BSA水解规律的影响,发现:Ficoll 70加入后BSA的水解度均显著降低,Ficoll 70加入量越大,降低作用越明显,其中,芽孢杆菌属蛋白酶酶解体系水解度的降低作用最明显,水解3h,由不加Ficoll 70的18.2降为加入30%(w/w)Ficoll 70的2.99%(P<0.05)。Tricine-SDS-PAGE结果也显示,大分子拥挤环境明显降低小分子肽的生成;2.考察了Ficoll 70对三种蛋白酶活性的影响,结果表明,Ficoll 70能显著降低酶活性,加入20%(w/w)的Ficoll 70后芽孢杆菌属蛋白酶活性降低49.82%、胰蛋白酶活性降低51.20%(P<0.05)、胃蛋白酶活性降低69.47%。同时,进行酶促反应动力学实验,芽孢杆菌属蛋白酶的Km与Vmax均减小,胰蛋白酶与胃蛋白酶的Km与Vmax均先增大再减小;3.探究Ficoll 70加入后蛋白酶结构的变化。Ficoll 70加入后蛋白酶的内源性荧光光谱发生最大波长红移或双峰现象;圆二色谱结果显示,Ficoll 70加入未引起二级结构含量的明显改变;分子动力学模拟结果表明:大分子拥挤环境改变了荧光位点与酶活性位点之间角度与距离的变化,降低其构象的灵活性。由此认为,大分子拥挤环境下蛋白酶活性发挥和酶解规律的变化与蛋白酶结构的变化密4.切相关;5.设计细胞膜内表面大分子拥挤传感器。根据现成的基于FRET原理设计的大分子拥挤传感器,引入跨膜区(DPP4、ACE和AQP),将其固定在细胞膜内表面。加入200mM氯化钠作用10min后,YFP/CFP均增加,其中ACE-MC增加最明显为19.31%(P<0.05),发现合成的三种传感器均能对拥挤信号进行表征,并通过膜蛋白提取及荧光显微镜拍照实验,从侧面验证了三种传感器中DPP4-MC能在细胞膜上实现良好的表达。