艾滋病是一种由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的全球重大流行性疾病。高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)是目前艾滋病临床治疗中使用的主要方法,然而这种疗法所涉及的药物会对人体产生许多副作用,并且无法彻底清除感染者体内潜伏的病毒。因此,研发一种有效对抗艾滋病的预防性或治疗性疫苗势在必行。然而经过30多年的努力,人们却仍未能成功研制出一种有效的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研究进展缓慢的主要原因是由于HIV具有高度的变异性,因此很难找到一种疫苗可以预防各种亚型HIV的感染并抑制不断变异的病毒在体内复制。并且,HIV在感染人体宿主细胞后,其病毒基因组会整合到宿主细胞的染色体中,这导致病毒一旦侵入人体就无法被彻底清除。因此,出于安全性方面的考虑,在传统疫苗研制策略中十分有效的灭活疫苗或减毒活疫苗方法均无法直接应用于艾滋病疫苗的研究。在一些早期研究中,人们发现利用猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)制备的减毒活疫苗在非人类灵长类动物(non-human primate,NHP)模型中表现出了有效的免疫保护作用。但这种SIV减毒活疫苗也会使接受免疫的幼年和成年猴子最终患上艾滋病。因此,如何能够避免HIV减毒活疫苗的缺陷,提高其安全性和免疫原性,是一个十分有意义且亟待解决的问题。HIV病毒基因组所编码的整合酶在病毒c DNA整合进宿主细胞基因组的过程中发挥着重要的作用。整合缺陷型的HIV病毒在感染宿主细胞后不会发生整合,但能通过一些游离在细胞质中的非整合型染色体外DNA(extrachromosomal DNA,E-DNA)继续进行转录并翻译成病毒蛋白,并且这些E-DNA可以在某些分裂增殖不活跃的细胞中存在很长一段时间。通过细胞质中的E-DNA转录和翻译出的病毒蛋白可以作为疫苗的抗原来刺激免疫系统产生病毒特异性的免疫反应。因此,整合酶缺陷型的HIV可以成为一种更加安全的HIV减毒活疫苗构建策略。已有研究报道了以HIV和SIV为基础的整合缺陷型慢病毒载体(integration-defective lentiviral vector,IDLV)疫苗在小鼠模型中可以诱导较强的抗原特异性系统及粘膜免疫反应。但目前尚未在NHP模型中对这种IDLV疫苗所产生的免疫反应对攻毒后动物的保护效力进行评价。因此在本篇论文的研究中,我们选择了能够感染中国恒河猴的SIV流行毒株SIVmac239作为基因改造对象,围绕其整合酶功能进行了多重突变与修饰,从不同角度保障疫苗的安全性;我们保留了SIVmac239全部病毒蛋白作为抗原,再利用可在真核细胞中启动高效基因表达的巨细胞病毒早期(Cytomegalovirus immediate early,CMV-IE)启动子替代病毒自身LTR启动子,来提高疫苗的免疫原性,最终得到了一种新型整合缺陷SIV(integration-defective SIV,idSIV)疫苗。在利用分子克隆技术成功构建出基因组改造质粒idSIV后,我们首先对其病毒学特征进行了鉴定。通过293T细胞转染和TZM-bl细胞感染实验发现,idSIV能够成功地包装出具有感染能力的病毒颗粒,但与野生型SIVmac239相比其感染力较弱。为了增强idSIV病毒的感染能力,我们用水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-G)与idSIV包装成嵌合型病毒,结果显示这种方法可以使idSIV病毒的感染力提高20倍以上。随后,通过感染CEM×174细胞,我们发现idSIV及其VSV-G嵌合型病毒在感染后均不会发生基因组整合,也不会在体外进行长期复制。但这些病毒仍可以在感染靶细胞后,通过游离在细胞质中的前病毒DNA表达病毒早期和晚期蛋白,提供能够刺激机体免疫系统的抗原。为了能够同时诱导产生细胞免疫和体液免疫反应,我们采用prime-boost策略将idSIV的DNA及其病毒颗粒进行联用,选取16只中国恒河猴作为实验对象,对其中8只进行了3次DNA和4次病毒颗粒免疫,另外8只在相同时间点注射PBS作为对照组。在免疫结束14周后,我们用剂量为50 TCID50的同源病毒SIVmac239对疫苗组和对照组动物进行了静脉单次攻毒。随后长达28周的跟踪检测结果显示,疫苗组动物体内的血浆病毒载量在急性感染期显著下降,在平台期也能够观察到一定的抑制作用。在对定期收集的样品进行T细胞免疫反应、结合抗体、中和抗体以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)作用检测后发现,idSIV DNA能够诱导产生主要针对Gag的T细胞免疫反应,而体液免疫反应则主要由病毒颗粒诱导产生,产生的中和抗体可以对tier 1A的异源SIVmac251病毒产生较强的中和作用,但对自体同源SIVmac239病毒的中和能力较弱;7只猴子中有4只猴子体内可以检测到ADCC作用。随后,我们从免疫学和病毒学两方面对疫苗产生的保护效力进行了深入分析。通过对急性感染期动物体内的病毒序列进行高通量测序和表位分析,我们在疫苗组动物体内病毒的Nef、Gag和Env蛋白序列中发现了6个特有的氨基酸突变,这些突变可能是在疫苗诱导的T细胞免疫反应和体液免疫反应的免疫选择压力下产生的。为了进一步分析idSIV DNA和病毒颗粒所诱导的免疫应答反应在降低急性感染期血浆病毒载量方面的作用,我们又将idSIV DNA和病毒颗粒分别单独对2只中国恒河猴进行了免疫,证实了由疫苗引起的T细胞免疫反应主要由idSIV DNA诱导产生而体液免疫反应主要由病毒颗粒诱导产生这一结果,并发现idSIV DNA免疫对控制病毒在急性感染期的复制至关重要。最后,我们探索了idSIV DNA作为治疗性疫苗应用的可能性,发现其对慢性感染期的病毒复制也能起到一定的控制作用。综上,本篇论文成功构建了一种新型整合缺陷型SIV疫苗,并在恒河猴体内深入评价,研究了其免疫原性、保护效力及其诱导的免疫选择压力下的病毒学特征。通过这些研究结果,我们对idSIV prime-boost联合免疫疫苗发挥作用的机制和产生保护效力的关键因素进行了合理的分析和阐释。希望本篇论文的研究,能够为新型艾滋病疫苗的设计以及相关免疫机制的研究提供一定的理论和实验基础。