全喉切除术使大量晚期喉癌病人的生命得以挽救,但同时也造成喉功能的永久丧失,严重影响了患者术后的生活质量,目前仍然没有理想的修复重建方法。为解决这一问题,人们尝试进行喉移植,这一方法却带来了新的问题:一方面同种异体的人类喉移植供体来源不足;另一方面严重的免疫排斥反应限制了喉移植的开展,终身应用免疫抑制剂可部分降低免疫排斥对移植物的破坏作用,但易引起患者肿瘤复发转移、感染和免疫力低下等问题。组织工程方法的不断发展为很多组织和器官的修复重建提供了可能。在皮肤、软骨等较简单组织的研究取得重大突破的启示下,研究人员也尝试利用组织工程方法再造全喉。由于全喉结构精细复杂,目前研究工作多集中在部分喉缺损的重建方面,全喉作为整体进行组织工程再造还需要在理论和技术上进一步创新。近年来去细胞生物支架研究的不断发展为这一难题的解决提供了新思路,去细胞技术在有效去除器官或组织内细胞的同时保留了最接近机体的天然结构和微环境。理想的组织工程支架材料除了具有一定的理化性能之外,还需要有一定的机械强度维持形态。侯楠等[1]利用动脉灌注的方法去除了兔喉黏膜和肌肉内细胞,保留软骨组织维持喉形态,得到完整的去细胞全喉支架。随后取骨髓间充质干细胞诱导培养成骨骼肌细胞后接种于喉支架的去细胞基质中。在移植入体内培养后有肌束样组织出现,马瑞娜等[2]还对灌注得到的兔去细胞全喉支架进行免疫学研究,结果显示该支架生物相容性好,免疫原性低。但灌注方法对软骨支架是否破坏了软骨的生物力学性能,喉支架还能否满足支撑作用仍不确定。本研究旨在利用完整喉软骨做支架,通过双侧颅甲动脉顺行持续注入去离子剂,有效去除喉部肌群和黏膜等免疫原性强的组织,制备出低免疫原性的犬去细胞喉支架,并明确该支架在灌注前后生物力学性能是否改变,进一步评价同种异体生物人工喉支架的性能,为全喉重建提供新方法。目的1.在兔喉灌注的基础上,改良灌注方法制备去细胞犬喉支架。探讨制备犬喉支架的可行性和寻找最佳灌注方法。2.对正常未灌注喉的软骨组织和灌注后的去细胞喉支架的软骨组织进行组织学和力学性能的比较,明确灌注法制备的去细胞喉支架的生物力学性能是否发生了显著改变,能否满足支架再植入体内的力学要求,为下一步喉缺损的修复提供理论和实验基础。方法1.灌注法制备犬去细胞全喉支架取离体犬全喉通过双侧颅甲动脉顺行持续注入去离子剂,有效去除喉部肌群和黏膜等免疫原性强的组织,保留喉部肌肉的细胞外基质的空间结构和完整喉软骨支架,制备出低免疫原性的犬去细胞喉支架,并对制备的去细胞全喉支架进行大体、组织学和扫描电镜观察。2.犬去细胞全喉支架的生物力学研究对灌注法制备的去细胞全喉支架和正常未灌注喉进行Masson三色、阿尔新蓝染色观察,利用专业图像分析软件IPP (image-pro plus)对切片行胶原和糖胺聚糖含量定量分析;扫描电镜观察和生物力学检测。结果1.灌注法制备犬去细胞全喉支架大体观察:对照组新鲜离体喉颜色鲜红,结构完整;灌注组离体喉经十二烷基硫酸钠(SDS)灌注三小时后环甲肌可透明,20h后肌肉及粘膜完全透明,喉颜色苍白,结构完整未出现塌陷、变形,除颜色改变外形态与对照组喉相比无明显变化。组织病理学观察:HE染色示对照组喉肌纤维束完整,肌细胞存在,软骨细胞充填于软骨陷窝中;实验组喉肌细胞已去除,纤维结构仍存在且保留了细胞外基质的方向性,软骨结构完整,大量活性细胞充填于软骨陷窝内。扫描电镜观察:对照组肌肉结构完整且无孔隙。灌注组肌肉细胞已完全去掉,纤维网状结构未破坏。2.犬去细胞全喉支架的生物力学研究Masson三色、阿尔新蓝染色:IPP软件分析切片结果显示对照组和灌注组无明显差异(P值均>0.05);扫描电镜观察软骨基质:灌注组软骨基质胶原纤维与对照组相比无明显变化,未见明显断裂;生物力学检测:压凹试验和拉伸试验对照组和灌注组无统计学差异(甲状软骨压凹试验,环状软骨压凹试验,甲状软骨拉伸试验P值均>0.05)。结论1.通过改良灌注法可有效去除犬喉的肌肉和黏膜,保留喉部肌肉细胞外基质的空间结构和完整喉软骨支架,制备出与人类喉更接近的犬去细胞全喉支架。2.灌注后的去细胞喉支架的软骨组织和未灌注喉的软骨组织组织学比较力学性能未发生明显改变,灌注法制备的去细胞喉支架的生物力学性能良好,能满足支架再植入体内的力学要求。