牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD),主要引起偶蹄类家畜动物感染及并发症,对我国畜牧养殖业造成巨大经济损失。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在全世界范围内广泛传播,其主要的临床症状表现为腹泻,急、慢性黏膜疾病以及持续性感染和免疫耐受等,主要引发母畜流产、死胎以及畸形胎等。新疆是我国主要的畜牧业生产基地,也是该病流行的主要地区之一。然而目前对于该疾病的防制,尚无有效的治疗方法,因此,该病给畜牧养殖业、食品生产业带来了巨大的安全隐患以及经济损失。美国科学家发现骆驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体,为抗体的制备以及研发开启了新篇章,克隆其可变区得到的抗体称为单域抗体,因其体积较小又称为纳米抗体(nanobody)。纳米抗体具有耐高温、易在原核系统中表达、亲和力好、组织穿透性强等诸多优点。[目的]利用噬菌体展示技术从抗BVDV纳米抗体基因文库中进行筛选,可以得到高效高特异性的纳米抗体,为研发防治BVDV的生物制剂奠定基础。[方法](1)对标准株牛病毒性腹泻病毒BVDV-E2基因全序列进行分析,发现其中包含大量的大肠杆菌稀有密码子以及疏水结构区,将其进行同义突变改造。同时,在此基础上对BVDV-E2基因编码蛋白的抗原表位进行预测分析;(2)利用噬菌体展示技术,将构建的BVDV纳米抗体文库进行辅助噬菌体(M13K07)的重新拯救并大量扩增,经过拯救及扩增后的文库大约为1.34×1013 cfu/ml。然后进行三轮的特异性亲和筛选,对筛选得到的单克隆进行序列测定及分析;(3)对分析成功的序列进行设计引物、并利用PCR技术对基因片段进行大量扩增,构建p EGX-4T--VHH原核表达载体,通过SDS-PAGE实验对目的蛋白进行检测并通过Ni柱将表达的蛋白进行纯化,然后进行蛋白的透析、浓缩;(4)利用双夹心ELISA对纳米抗体结合性验证,通过病毒侵染MDBK细胞进行功能的初步验证。[结果](1)发现在BVDV-E2区中有一段较密集长度为630bp的抗原表位区域,选取该区域片段在大肠杆菌中进行表达、纯化及功能验证,显示获得预期的抗原蛋白;(2)BVDV-E2纳米抗体的筛选得到阳性单克隆。将阳性单克隆进行序列测定分析及比对,确定序列为驼科重链抗体片段;(3)BVDV-E2蛋白纳米抗体在原核系统中成功表达获得大小为49.5KD的蛋白并纯化;(4)纳米抗体中和病毒功能的验证结果显示纳米抗体蛋白可以中和病毒从而保护MDBK细胞不被破坏。[结论]本实验利用原核表达的BVDV-E2抗原表位蛋白成功的从已构建好的抗体文库中筛选得到特异性针对BVDV-E2的纳米抗体,该纳米抗体能够中和BVDV,在一定程度上保护MDBK细胞避免发生病变,为研究BVDV的治疗以及防治奠定了非常重要基础。