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肝硬化晚期常因中枢神经系统(CNS)的功能调节紊乱,引起肝性脑病的发生。肝硬化门静脉高压与门静脉系统血流受阻及内脏血流高动力循环有关,导致了血液许多活性物质的代谢失调。研究发现肝硬化外周血液循环一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量明显高于正常水平,暗示NO可能参与了肝性脑病的病理生理,因而受到越来越多的重视。5-HT是中枢神经系统重要的神经递质,在神经系统分布广泛,对机体的心理、行为及情绪等有着重要的调节作用。近年的研究发现肝硬化患者血液循环5-HT明显增多,推测5-HT参与了肝性脑病的发生。
以往的研究表明,中缝背核除5-HT能神经元外,还存在较多的NOS阳性神经元。肝硬化后中缝背核5-HT及NOS阳性神经元是否受到累及目前尚不十分清楚。
因此,本实验通过皮下注射四氯化碳油溶剂建立肝硬化大鼠实验动物模型;利用免疫组织化学、NADPH-d组织化学及NADPH-d复合免疫组织化学的方法,观察肝硬化大鼠中缝背核5-HT能神经元及NOS阳性神经元的形态及表达的改变,为二者可能参与肝硬化导致的肝性脑病提供一定的实验依据。
目的:观察肝硬化大鼠中缝背核5-HT及NOS的表达改变,推测其在肝硬化所致肝性脑病发病中的作用。
方法:选用成年雄性Wistar大鼠30只,体重150-200g,随机抽出10只为正常对照组,剩余动物20只为实验组。实验组给予60%CC14溶液皮下注射结合5%乙醇自来水溶液饮用。首次每只大鼠0.5ml/100g,以后每只0.3ml/100g,每周注射2次,共14周;对照组每周背部皮下注射生理盐水,自来水饮用,其余同模型组。肝组织HE染色,确定肝硬化的形成;以免疫细胞化学染色观察中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的变化、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-黄递酶(NADPH-d)染色观察中缝背核NOS阳性神经元的变化,并对中缝背核行NADPH-d染色复合5-HT免疫细胞化学染色。应用IPP6.0图像分析系统分析对照组和肝硬化组大鼠的5-HT免疫反应阳性神经元、NADPH-d阳性神经元的神经元数目及细胞平均直径和平均光密度值;应用奥林巴斯显微镜于40倍物镜下计数1cm2范围的中缝背核NADPH-d复合5-HT免疫细胞化学的双标神经元数目。
结果:
1.HE染色结果:对照大鼠肝组织肝小叶结构完整,肝板条索状以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞无变性、坏死;肝硬化大鼠肝细胞溶解,弥漫性大片坏死,残留肝细胞成片气球样变;肝细胞呈小灶状坏死明显多于对照组,有统计学意义(P<0.01)。
2.免疫细胞化学染色结果:对照组大鼠脑内5-HT免疫反应阳性神经元主要集中在中脑下丘阶段,从低倍镜下观察可见位于中脑水管腹侧与两侧内侧纵束之间的多细胞聚集区;位于中央管腹侧的中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元整体形态呈喷泉样;与对照组大鼠相比,肝硬化大鼠中缝背核5-HT免疫反应神经元在分布上未见显著区别,但免疫反应强度明显高与对照组大鼠。(1)肝硬化大鼠中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的数量:正常对照组大鼠中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的数量为104.04±25.99;肝硬化组中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的数量为101.46±24.18。与对照组相比,无显著性意义(P>0.05)。(2)肝硬化大鼠中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的直径:正常对照组大鼠中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的直径为10.471±0.62;肝硬化组中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的直径为9.759±0.44。与对照组相比,肝硬化组5-HT免疫反应阳性神经元的直径明显变小,比对照组降低了6.80%,有统计学意义(P<0.05)。(3)肝硬化大鼠中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元的平均光密度:正常对照组中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元平均光密度值为0.477±0.040;肝硬化组中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元平均光密度值为0.528±0.041。与对照组相比,肝硬化组大鼠中缝背核5-HT免疫反应阳性神经元免疫反应强度明显增强,比对照组增加了10.70%,有统计学意义(P<0.05)。
3.NADP-d染色结果:对照组大鼠中缝背核多数NOS阳性神经元为蓝色深染;NOS阳性神经元及纤维散在分布于中缝核各部分,中缝背核较为密集,尤其是中缝背核背侧和腹侧神经元数量较多。与对照组相比,肝硬化组大鼠中缝背核NOS神经元染色明显变浅。(1)肝硬化大鼠中缝背核NOS阳性神经元的数量:正常对照组大鼠中缝背核NOS神经元的数量为47.88±6.17;肝硬化组中缝背核NOS神经元的数量为28.50±4.00。与正常对照组相比,肝硬化大鼠中缝背核NOS阳性神经元数量显著减少,比正常对照组降低了40.48%,有统计学意义(P<0.01)。(2)肝硬化大鼠中缝背核NOS阳性神经元的大小:正常对照组大鼠中缝背核NOS阳性神经元平均直径为12.42±1.89;肝硬化组中缝背核NOS阳性神经元平均直径为10.72±0.41。与正常对照组相比,肝硬化大鼠中缝背核NOS神经元直径显著减少,比正常对照组降低了13.67%,有统计学意义(P<0.05)。(3)肝硬化大鼠中缝背核NOS能神经元的光密度值:正常对照组中缝背核NOS阳性神经元平均光密度值为0.042±0.010;肝硬化组中缝背核NOS阳性神经元平均光密度值为0.014±0.002。与对照组相比,肝硬化组中缝背核NOS阳性神经元免疫反应强度明显降低,比对照组降低了66.670%,有统计学意义(P<0.01)。
4.NADPH-d染色复合5-HT免疫细胞化学结果:在中缝背核NADPH-d染色复合5-HT免疫细胞化学的切片,NOS复合5-HT免疫反应阳性神经元主要集中在中缝背核背侧部和中缝背核腹侧部。这两个中缝背核亚核团中的5-HT阳性神经元中仅部分5-HT能免疫反应阳性神经元为NOS阳性。对照组中缝背核背侧部双标细胞平均数量为8.00±5.20,占5-HT能神经元的50%;中缝背核腹侧部双标细胞平均数量为32.33±16.01,占5-HT能神经元的60.62%;与之相比,肝硬化组中缝背核背侧部双标细胞平均数量为8.75±2.06,占5-HT能神经元的53.03%;中缝背核腹侧部双标细胞平均数量为25.75±9.53,占5-HT能神经元的56.91%。与对照组大鼠相比,肝硬化大鼠双标神经元无明显区别(P>0.05)。
小结:
1.CCL4皮下注射能够引起肝细胞变性坏死导致肝硬化。
2.肝硬化引起大鼠中缝背核5-HT能神经元变小、5-HT增加。
3.肝硬化引起大鼠中缝背核NOS阳性神经元数目减少、直径变小、NOS表达减弱。