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无义介导的mRNA降解途径(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是真核生物的一种依赖翻译过程的mRNA质量监控途径。它可以识别并降解含有提前终止密码子(premature termination codons,PTC)的异常mRNA(PTC-mRNA),避免了截短型蛋白质对细胞的潜在危害。目前对于NMD途径的研究主要集中在PTC-mRNA的识别、NMD途径的激活和异常mRNA的降解机制,尤其是针对高等真核生物和酵母NMD机制的研究较多,但对原生动物NMD途径机制的研究还很少。本文选择处于真核生物进化基部的蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)为实验材料,对其NMD途径因子的关系和功能进行分析,通过研究原生动物NMD途径的特点,为阐明真核生物的NMD分子机制及其进化提供数据支持。在本研究中,我们克隆得到贾第虫UPF1(GlUPF1)、SMG1(GlSMG1)和肽链释放因子(GleRF1、GleRF3)的基因,通过分析这些NMD因子之间的相互作用和GlSMG1的激酶功能来研究贾第虫NMD途径的激活机制。首先,构建带有GleRF1、GleRF3和GlUPF1的重组质粒,用于双分子荧光互补实验、酵母双杂交实验和体外pull-down实验,分析GlUPF1与蓝氏贾第虫的肽链释放因子之间的作用关系。实验结果表明,GlUPF1与GleRF1、GleRF3均可以发生相互作用。然而,我们发现GleRF1不能与截短的GlUPF1发生相互作用,但GleRF3能与GlUPF1(1-500 aa)作用。这表明GleRF1与GlUPF1的相互作用可能依赖于其结构的完整性,而GleRF3与GlUPF1作用的区域为GlUPF1(1~500 aa)即包含CH结构域的部分。以上结果表明,GlUPF1能与GleRF1、GleRF3形成稳定复合体。接着,克隆得到GlSMG1各结构域(GlHEAT、GlFAT+FRB、GlPIKK)的基因,构建用于双分子荧光互补、酵母双杂交和体外pull-down实验的重组质粒,分析GlUPF1与GlSMG1各结构域之间的相互作用关系。结果表明,GlUPF1能与GlSMG1各结构域相互作用,且GlSMG1的激酶结构域GlPIKK能与GlUPF1的各截短体相互作用。进一步检测这些相互作用实验组的β-半乳糖苷酶活性发现,GlPIKK与GlUPF1的作用强度是最强的,且GlUPF1两种截短体GlUPF1(1~500 aa)和GlUPF1(501~1304 aa)与GlPIKK作用的β-半乳糖苷酶活性较高。这些结果表明,GlSMG1能与GlUPF1作用,且GlPIKK是GlSMG1与GlUPF1作用的主要结构域,主要结合GlUPF1的N端和C端。以上结果表明GlSMG1能与GlUPF1作用,接着我们研究GlSMG1对GlUPF1的磷酸化修饰。利用体外磷酸化反应体系,使GlPIKK对GlUPF1截短体产生磷酸化修饰,通过蛋白质磷酸化水平检测试剂盒检测GlUPF1截短体蛋白的磷酸化水平。结果表明,GlPIKK能磷酸化GlUPF1(1~500 aa)和GlUPF1(501~1 304 aa)。为了探究GlUPF1上的磷酸化位点有哪些,进一步利用NetPhos 3.1软件在线预测GlUPF1的潜在磷酸化位点,选择Ser72、Thr111、Ser1271三个位点进行定点突变。原核表达纯化各突变体蛋白,后经过体外磷酸化反应并检测它们的磷酸化水平,结果表明GlUPF1(1~500aa)T111A的磷酸化水平明显降低,这表明T111可能是GlUPF1上的一个磷酸化位点。综合以上研究结果表明,蓝氏贾第虫NMD途径起始阶段,首先在mRNA的PTC处的核糖体上形成SMG1-UPF1-eRF1-eRF3(SURF)复合体,并且GlSMG1磷酸化修饰GlUPF1,由此激活NMD途径,可能招募XRN1酶参与无义mRNA的降解。这为后续研究蓝氏贾第虫的NMD下游机制奠定基础,也有助于进一步理解NMD途径的起源和进化,揭示该通路分子机制在进化上的多样性,为进一步阐明NMD机制提供数据支持。