脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS）是一种常见的遗传性智力低下疾病，它的遗传学基础是由于X连锁的脆性X智力低下一号基因（fragile X mental retardation gene1，Fmr1）5’端的(CGG)n三核苷酸重复序列扩增异常及与其相邻的CpG岛异常甲基化,致使Fmr1基因编码的产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)缺如或减少所致。脆性X综合征有一个显著的特点是患者有痛觉敏感性下降导致的自我伤害行为。还有不同程度的智力低下,学习记忆力减退，活动过度，以及癫痫患病率增高等症状。而Fmr1基因敲除小鼠（Knockout mice，KO鼠）也有许多上述类似表现。因此，我们推测Fmr1基因敲除小鼠痛觉处理系统异常，可能存在痛觉敏感性下降。目前，FXS患者的自残行为的神经生物学机制尚不明了，本研究小组的前期研究发现 Fmr1基因敲除小鼠皮层和海马的丝氨酸-磷酸化-糖原合成酶激酶-3（serine-phosphorylation of GSK3，P-GSK3）表达减少，锂剂可以通过增加P-GSK3的表达来改善KO鼠学习记忆减退的表型。有研究显示神经生长因子（nerve growth factor，NGF）可通过磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）信号途径激活糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）而改变小鼠痛觉的敏感性。在KO鼠的脊髓中P-GSK3的表达是否存在异常，KO鼠痛觉敏感性下降是否与此有关？这些问题都有待于进一步研究和探讨。　　有研究表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通过调节蛋白质的合成，影响突触传递效能，参与长时程增强（long term potentiation，LTP）的形成，介导痛觉的中枢敏化，从而参与病理性疼痛的形成与维持；还有研究显示 GSK3可通过 TSC1/2复合体（the tuberous sclerosiscomplex1/the tuberous sclerosis complex 2）对mTOR的活性进行调节；这些研究结果提示mTOR参与了痛觉的调制并可能受到GSK3的调节。但mTOR是否参与Fmr1基因敲除小鼠痛觉异常的形成机制，与GSK3的关系又是如何？目前尚不清楚。　　本研究旨在探索Fmr1基因敲除小鼠是否存在痛觉敏感性下降，在脊髓水平初步探索磷酸化丝氨酸-9-糖原合成酶激酶-3β（phospho-Ser9-GSK3β，P-GSK3β）及mTOR在Fmr1基因敲除小鼠痛觉敏感性改变的机制中的作用及两者之间的关系，初步探讨FXS患者自残行为的生物学机制。　　【研究目的】　　本研究通过对Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠（Wild type mice，WT鼠）的热刺激缩足反射潜伏期（PWTL）的测定，明确KO鼠的痛觉敏感性是否下降；同时通过免疫组织化学方法，蛋白免疫印迹实验，观察KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的GSK3β，P-GSK3β及mTOR的表达与WT鼠是否有差别；并了解使用GSK3抑制剂氯化锂后，KO鼠的痛觉异常能否恢复至WT鼠的水平，脊髓中GSK3β、P-GSK3β及mTOR表达是否发生改变及它们之间的相互关系，初步探讨它们在Fmr1基因敲除小鼠在脊髓水平痛觉敏感性改变机制中可能的作用。　　【材料和方法】　　1.实验动物：纯合子（-/-）Fmr1基因敲除型（KO）及其纯合子(+/+)野生型(WT) FVB近交系小鼠。　　2.动物基因型鉴定：采用PCR法检测实验小鼠的Fmr1基因片段。　　3.动物分组：　　3.1、用于痛觉敏感性测定的8周龄的45只KO鼠及45只WT鼠均分成空白对照组、生理盐水组和氯化锂组，每组15只。4周龄的小鼠只设KO组及WT组，每组15只。　　3.2、用于免疫组织化学实验8周龄的12只KO鼠及12只WT鼠均分成空白对照组、生理盐水组和氯化锂组，每组4只。4周龄的小鼠只设KO组及WT组，每组4只。　　3.3、用于蛋白免疫印迹实验8周龄的12只KO鼠及12只WT鼠均分成空白对照组、生理盐水组和氯化锂组，每组4只。4周龄的小鼠只设KO组及WT组，每组4只。　　4.实验方法及观测指标：8周龄小鼠第一天测定PWTL值，作为基础痛阈，第2，3，4，5天均按4mmol/kg腹腔注射氯化锂，给药30分钟后测定PWTL值，第6天给药30分钟后灌注固定取腰骶膨大段脊髓行免疫组织化学实验，或脱臼处死取脊髓行蛋白免疫印迹实验。4周龄小鼠只测第一天的基础痛阈。观察KO鼠与WT鼠的基础痛阈是否不同，使用氯化锂后8周KO及8周WT鼠痛觉敏感性如何变化，并通过蛋白免疫印迹实验及免疫组织化学实验对8周KO及8周WT鼠用药前后腰骶膨大段脊髓的GSK3β、P-GSK3β和mTOR的表达做定量和定性分析。　　5.数据及图像的采集：PWTL值通过PL-200热刺痛仪打印；免疫组织化学实验结果用光密度法分析，免疫印迹实验结果用光密度法（Quantity One）定量，用同一块胶上的目的蛋白与内参蛋白测得值的比值作为统计分析数值。　　6.统计方法：所有结果均用`X±S表示，用SPSS17.0统计软件分析；KO与WT小鼠所有实验参数的比较采用独立样本t检验；KO及WT用药前后实验参数的比较采用单因素方差分析，所有的检验P＜0.05具有统计学意义。　　【实验结果】　　1.经基因鉴定，KO组小鼠均为纯合子（-/-）Fmr1基因敲除型；WT组小鼠均为纯合子(+/+)野生型。　　2.行为学实验结果：4周龄及8周龄KO鼠的基础痛阈均比同周龄的WT鼠的基础痛阈高，即4周龄及8周龄KO鼠痛觉敏感性低。8周龄KO鼠使用氯化锂后痛觉阈值下降，且与同周龄WT鼠相比，差异无统计学意义，即8周龄KO鼠使用氯化锂后痛觉敏感性恢复正常。　　3.免疫组织化学实验结果：GSK3β、P-GSK3β、mTOR广泛表达于脊髓灰质的神经元的胞浆中，部分前角神经元可见胞核中有P-GSK3β表达，与同周龄的WT鼠相比，4周龄及8周龄 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β、mTOR的表达明显减少。使用氯化锂后，8周龄 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β及mTOR的表达均增多，而8W龄WT鼠的变化不明显。4周龄及8周龄 KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的GSK3β的表达和WT鼠无明显差别。与用药前相比，8周龄KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的GSK3β的表达均无明显改变。　　4.免疫印迹实验结果：与同周龄的WT鼠相比，4周龄及8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段P-GSK3β、mTOR的表达明显减少。使用氯化锂后，8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段P-GSK3β及mTOR的表达均增多，而8W龄WT鼠的变化不明显。4周龄及8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段的GSK3β的表达和WT鼠无明显差别。与用药前相比，8周龄KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段的GSK3β的表达均无明显改变。　　【结论】　　1．KO鼠热痛觉阈值增高，热痛觉敏感性降低。　　2．KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的P-GSK3β、mTOR表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一。　　3．氯化锂可能通过增加脊髓后角中的P-GSK3β的表达而使脊髓后角中的mTOR的表达增加。