研究背景皮肤作为人体面积最大的器官担负着保护人体内部结构和各大脏器系统的重要功能。一旦受到损伤,皮肤就会迅速的产生各种应激性反应,最终达到瘢痕愈合。瘢痕是人体创伤后自身修复的必然产物,没有瘢痕形成就没有愈合,瘢痕是临床愈合的标志。瘢痕只有在过度增生等情况下,引起机体不适或造成畸形及功能障碍时,才被认为是病理现象。引起病理现象的瘢痕称之为病理性瘢痕,是在创伤愈合过程中,受局部微环境的影响,基因的表达发生变化,从而影响到瘢痕的转归。临床多见的有增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩。由于增生性瘢痕与瘢痕疙瘩在临床表现上极其相似,人们很易混淆两种疾病的概念。以往研究已证实,瘢痕疙瘩除了具有一般病理性瘢痕的特性外,还有着“肿瘤样生长”倾向、病变超出原损伤区、有特殊的高发部位、手术切除后极易复发等特点。而增生性瘢痕多半是局部性生长,病变不超出原损伤区。其发生均为机体自身过度修复的结果。病理性瘢痕的主要病理表现为瘢痕组织内胶原及基质成分的大量沉积。其发病机制迄今未明,临床上瘢痕疙瘩的发病可以是因为一些非常轻微的损伤(如穿耳、注射或暗疮破溃)或是无明显的诱因,表现为病程长,多持续增长,无自行萎缩倾向。青壮年多发,好发于耳垂、前胸、上颈区、肩以及女性剖腹产伤口的耻骨联合部等特殊部位。其病程长,不断扩增,有时伴有痛痒症状的表现；而增生性瘢痕,不超出病损区,增生可以自限,但病程时间亦较长。在暴露部位的病理性瘢痕影响美观,造成容貌损害等等,均给患者造成严重的心理负担。病理性瘢痕是目前整形外科的常见病,治疗方法有限,尤其是瘢痕疙瘩,人们尝试用不同的方法来治疗瘢痕疙瘩,但遗憾的是,到目前为止无论是手术治疗还是非手术治疗,或者是联合治疗,仍然没有一种完善的治疗方案可以获得稳定又满意的疗效。虽然病理性瘢痕是一种良性疾患,但是它的病理特点和临床特征给患者带来了生理和心理上的痛苦。临床上缺乏满意的治疗手段,也给整形外科医师带来了工作上的困扰。如何预测和干扰瘢痕疙瘩的形成一直是本领域研究的热点。本课题组先前的研究发现瘢痕疙瘩外周血淋巴细胞中p53基因外显子4第72位密码子的基因型分布存在多态性,而且这种多态性分布在普通人群及瘢痕疙瘩人群中存在差异。这种分布的差异为临床筛选瘢痕疙瘩易感人群提供了理论及实验依据。同时,为进一步推动研究的临床应用,前课题组在上述发现的基础上,成功研制了p53基因检测试剂盒。该试剂盒是应用ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法)及PCR-反向斑点杂交技术来对p53基因外显子4第72位密码子的基因型进行鉴别。前课题组应用该试剂盒通过提取DNA样本；设计扩增p53基因外显子4片段的引物,多聚酶链反应对DNA样本进行扩增；设计与外显子4第72位密码子两种不同等位基因相吻合的探针,制备显色膜条,应用反向斑点杂交技术,通过三种不同的显色结果判定待检者p53基因外显子4第72位密码子的基因型。最后统计分析三种基因型的分布差异,得出结论：人类p53基因外显子4中72位密码子C等位基因及CC基因型可能是中国广东地区汉族人群瘢痕疙瘩的易感因素,瘢痕疙瘩p53基因检测试剂盒是一种可以初步预测瘢痕疙瘩易感人群的检测手段。有文献报道,亚洲黄色人种瘢痕疙瘩临床发病率在2.3%o,而增生性瘢痕的发生率明显高于瘢痕疙瘩,虽然无向正常皮肤浸润、持续增生的病理特征,但临床表现极为相似,同样困扰患者,影响他们的日常生活。在p53基因异常表达方面的研究,有学者报道,增生性瘢痕与瘢痕疙瘩之间无显著性差异；在p53基因多态性的研究中有学者发现CCC/CCC基因型者增生性瘢痕的发生率提高。于是我们考虑在检测p53基因codon72多态性筛查易感人群时,将增生性瘢痕纳入其中,统称为病理性瘢痕的易感人群的筛查。目前临床上尚无预测病理性瘢痕易感人群的检测手段,本课题旨在通过研究p53 codon72多态性与病理性瘢痕的相关性,用更准确快速的方法检测易感人群,为临床患者做好预防性治疗奠定基础。实验目的：1.建立荧光分子信标PCR检测P53基因SNP的方法(荧光探针标记法),提高准确率,简化操作,降低成本,缩短时间,使之更易于临床推广。2.应用荧光分子信标PCR法对剖腹产女性进行大样本量p53基因codon72多态性的临床筛查,并对受测者进行临床随访,观察临床患者瘢痕转归与基因型的相符性。为临床预测病理性瘢痕的发病风险提供依据。研究对象及方法：研究对象：一组为瘢痕疙瘩组,收集临床上已知的瘢痕疙瘩患者28例。另一组为剖腹产术后组,收集260例剖腹产术后女性(刚做完剖腹产一周内的产妇)的外周静脉血样本及相关临床资料。选择剖腹产女性,手术部位较恒定。两组排除了病理性瘢痕及肿瘤史。实验方法：抽取待测人群的外周静脉血,提取全血中的DNA样本；两组均采用分子信标荧光PCR法检测P53基因codon72多态性.瘢痕疙瘩组设计一对p53基因第4外显子的第72密码子单核苷酸多态性(SNP)荧光分子信标探针,用Fam荧光分子标记CCC,用hex荧光分子标记CGC,在定量荧光PCR (Real-time PCR)仪检测该位点SNP,并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。根据已知p53基因72密码子SNP基因型样本的荧光定量测定结果,制定以下判别标准：以荧光强度≥空白管荧光强度2.0倍为阳性反应。单纯MBC探针(Fam绿色荧光)阳性判定为CCC/CCC纯合子；单纯MBG探针(HEX红色荧光)阳性判定为CGC/CGC纯合子；MBC探针(Fam绿色荧光)和MBG探针(HEX红色荧光)双阳性判定为CCC/CGC杂合子。通过三种不同的荧光显色结果判定待检者p53基因外显子4第72位密码子的基因型,通过比较,判断这种方法的优势。剖腹产术后组用分子信标荧光PCR法检测p53基因codon 72多态性,并统计分析三种基因型的分布差异,结合临床随访结果,观察基因型与临床病理性瘢痕的患病关系。实验结果本组实验共检测了临床瘢痕疙瘩组28例及剖腹产术后组260例的血样本中的p53基因codon72基因表达。瘢痕疙瘩组中p53基因外显子4第72位密码子显示基因型为C/C型为12人,占总数的42.87%；显示基因型为C/G型为10人,占总数的35.71%；显示基因型为G/G型为6人,占总数的21.43%。与DNA测序结果相同;再用反向斑点杂交法测试,显示三种基因型分别为C/C14例、C/G9例、G/G6例,与DNA测序结果吻合率为92.86%。分子信标荧光PCR法检测结果与DNA测序结果吻合,准确率为100%,高于反向斑点杂交法的为92.86%。分子信标法的灵敏度为42.86%,特异性为87.5%；反向斑点法的灵敏度为50%,特异性为83.34%。分子信标法的灵敏度低于反向斑点杂交法,但特异性高于反向斑点杂交法。统计剖腹产术后组与术后瘢痕增生组的基因型分布情况为：剖腹产术后组中p53基因codon72显示基因型为脯氨酸(C)/脯氨酸(C)型为46人,占总数的19.3%；显示基因型为脯氨酸(C)/精氨酸(G)型为117人,占总数的49.2%；显示基因型为精氨酸(G)/精氨酸(G)型为75人,占总数的31.5%。临床随访260例女性,发生瘢痕增生的22例,其对应的基因型分别是C/C型9例,占患病人数的40.9%,C/G型8例,占患病人数的36.36%,G/G型5例,占患病人数的22.72%。行统计学分析,实验结果示：临床上应用分子信标荧光PCR法对手术创伤后女性做p53基因codon72多态性的检测,基因型为C/C的产妇与基因型为C/G+G/G术后发生病理性瘢痕的风险差异有统计学意义,且高于基因型为C/G+G/G的产妇(P<0.05)。C/C纯合子与其他基因型相比较,与病理性瘢痕有较高的相关性,存在病理性瘢痕患病风险。实验结论人类p53基因第72位密码子多态性位点的基因型检测对发现病理性瘢痕的易感人群有临床指导意义；荧光探针标记法更新了瘢痕疙瘩p53基因检测试剂盒的方法,准确率高,更方便快捷,可以作为预测病理性瘢痕易感人群的检测手段,为临床上预测病理性瘢痕的发病风险提供一种新方法。临床意义推广和应用,为临床预测病理性瘢痕易感人群提供一种可能。对手术后女性前瞻性研究表明对病理性瘢痕易感人群的筛查,有临床指导意义。为需要手术的患者预测病理性瘢痕的患病风险,提前做好瘢痕的预防性治疗,尽量减少病理性瘢痕发生的可能性。一旦检测出阳性结果,对于未发病的瘢痕疙瘩易感者可以给予尽早的警示,尽量避免穿耳、挤破暗疮等不必要的损伤,降低患病风险,及时给予临床工作者避免瘢痕增生的警示和增强易感者自我防治的意识。PCR荧光分子信标检测技术优于PCR-反向斑点杂交法,更适合临床p53基因codon72 SNP快速诊断。瘢痕疙瘩p53基因检测试剂盒新方法具有检测准确、迅速、使用方便、成本不高等优点,临床上可以考虑作为检测病理性瘢痕患病风险的常规项目普及,弥补瘢痕检测项目的空缺。