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研究背景:胶质瘤起源于胶质细胞或前体细胞,分为星形细胞瘤、室管膜瘤和少突胶质细胞瘤,是中枢神经系统（CNS）最常见的恶性原发性肿瘤。此外,世界卫生组织（WHO）根据胶质瘤的恶性程度将其分为四类。WHO 1-2级的胶质瘤被称为低级别胶质瘤（LGG）,包括血管中心性胶质瘤和弥漫性星形细胞瘤,而WHO3-4级的胶质瘤被视为高级别胶质瘤（HGG）,包括间变星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤（GBM）。GBM有很高的死亡率和复发率,是恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤。目前GBM的标准治疗是通过神经外科手术切除肿瘤伴放射治疗及含TMZ（替莫唑胺）治疗,但即使采用手术联合放化疗,大部分胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仅15个月左右。在过去的几年里,贝伐单抗在包括脑胶质瘤在内多种肿瘤中取得了相对较好的疗效,但仍有超过30%的患者最初对抗血管生成治疗没有反应,最终相关患者都很快会复发,并死于该病。有证据表明,在血管生成中非编码RNA的调控起着重要的作用,尤其是长链非编码RNA和微小RNA。长链非编码RNA（lncRNAs）目前发现是不具备明显的蛋白质编码潜力的RNA,其长度超过200个核苷酸。长非编码RNA(lncRNAs在包括肿瘤进展在内的生理和病理过程中发挥着广泛的功能。据报道,调控lncRNAs可以影响血管生成。血管生成是一个复杂的多步骤过程,通过驱动新血管的形成,提供营养和能量加速癌症的进展。然而,lncRNAs调控胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移等多种生物学行为的潜在机制尚不清楚。我们通过高通量测序对比正常脑组织及不同恶性程度胶质瘤中的差异分子,综合考虑差异倍数、P值、FDR值,最终选择出本次研究的lncRNA WARS2-IT1。相对于正常脑组织,lncRNA WARS2-IT1的表达水平在胶质瘤组织中显著增高,并与胶质瘤的恶性程度成正相关。查阅lncRNA亚细胞定位生信网站,lncRNA WARS2-IT1位于细胞质中,但目前未检索到该基因在肿瘤方面的相关研究,其作用功能机制尚不明确。因此,本研究在以往研究的基础上,进一步总结了近年来在胶质瘤lncRNA调控领域的进展,探索lncRNA WARS2-IT1在胶质瘤发生发展及血管生成的具体机制,以期研究出精确的生物标志物和可靠的治疗靶点。研究目的:本研究拟在前期工作的基础上,首先在分子水平、细胞水平验证lncRNA WARS2-IT1及miR-299-3p在脑胶质瘤增殖和侵袭中的作用。通过小管形成实验,验证lncRNA WARS2-IT1通过miR-299-3p/VEGFA信号轴在脑胶质血管形成中的作用;在整体水平验证lncRNA WARS2-IT1/miR-299-3p/VEGFA信号轴与下游信号通路相关蛋白调控关系的分子机制;并收集脑胶质瘤术后标本及通过动物实验提取移植瘤,在组织层面研究lncRNA WARS2-IT1/miR-299-3p中RNA表达水平验证,从而阐明lncRNA WARS2-IT1通过miR-299-3p/VEGFA轴激活PI3K/AKT通路促进胶质瘤血管生成的分子机制,为探索脑胶质瘤的靶向治疗提供理论依据。研究方法:第一部分lncRNA WARS2-IT1在脑胶质瘤中的表达及临床意义方法:1.利用二代测序技术对4例胶质瘤与2例正常脑组织进行全转录组测序检测,分析lncRNA的表达并筛选差异的lncRNA;2.在胶质瘤与正常脑组织中利用Real-Time PCR方法检测lncRNA WARS2-IT1的表达水平;3.检测脑胶质瘤细胞系及正常脑组织细胞系中lncRNA WARS2-IT1表达;4.研究分析lncRNA WARS2-IT1表达水平与临床病理特征的相关性,生物信息数据库中进行lncRNA WARS2-IT1表达水平与胶质瘤患者预后相关性分析。结果:1.综合分析在上调的差异lncRNA中,所筛选的lncRNA WARS2-IT1在脑胶质瘤组织标本中表达水平明显增高（P＜0.05）。2.在胶质瘤与正常脑组织中利用RT-PCR方法检测lncRNA WARS2-IT1结果显示,其表达量明显高于正常脑组织,其中在55.8%（29/52）在脑胶质瘤样本中明显高表达（P＜0.05）,差异有统计学意义。相对于人正常胶质瘤HEB细胞系,lncRNA WARS2-IT1在胶质瘤U87,U118,U251和T98G细胞系中表达明显升高（P＜0.05）,相对于其他的两株细胞,该RNA在T98G和U251细胞中明显高表达。3.lncRNA WARS2-IT1表达水平与患者肿瘤大小、WHO分级、KPS评分相关（P＜0.05）,与性别、年龄、肿瘤位置及累及脑叶无显著相关。4.生信数据库结果显示,以lncRNA WARS2-IT1的表达中值为截止值（cut-off value）,比较lncRNA WARS2-IT1高表达（N=254）及低表达（N=256）患者的两组间总生存期,无病生存期具有显著差异（P＜0.05）,lncRNA WARS2-IT1高表达的患者生存率显著更低（P＜0.05）。第二部分沉默lncRNA WARS2-IT1抑制胶质瘤增殖、侵袭及血管生成方法:1.建立沉默lncRNA WARS2-IT1重组慢病毒载体,构建T98G、U251的慢病毒sh-WARS2-IT1稳转细胞株,RT-PCR检测转染后细胞内lncRNA WARS2-IT1表达情况。2.利用划痕实验、Cell counting Kit-8（CCK-8）、Transwell实验及EDU analysis技术,检测沉默lncRNA WARS2-IT1对T98G和U251细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。3.流式凋亡实验检测沉默lncRNA WARS2-IT1对T98G和U251细胞凋亡的影响。4.Tube formation assay小管生成实验检测沉默lncRNA WARS2-IT1后的血管生成情况。结果:1.结果显示慢病毒sh-WARS2-IT1稳转细胞株T98G、U251的沉默转染率较高,成功获取sh-WARS2-IT1的T98G、U251和HBMVEC稳转细胞株。2.划痕实验、CCK-8及Transwell、EDU实验结果显示在沉默lncRNA WARS2-IT1后,细胞增殖、侵袭、迁移能力明显受到抑制（P＜0.05）。3.流式凋亡实验结果显示在沉默lncRNA WARS2-IT1后,T98G和U251细胞凋亡数量明显增加（P＜0.05）。4.沉默lncRNA WARS2-IT1可以明显抑制胶质瘤血管生成（P＜0.05）。第三部分沉默lncRNA WARS2-IT1通过调控miR-299-3P/VEGFA轴抑制胶质瘤增殖、侵袭及血管生成方法:1.首先对lncRNA WARS2-IT1亚细胞定位进行检测。2.利用生物信息学分析网站或工具分析刷选与lncRNA WARS2-IT1及VEGFA具有共同应答原件的miRNA,并验证其在胶质瘤组织及T98G和U251细胞中的表达水平。3.分别将miR-299-3p的模拟物mimics,抑制物inhibitor转染至T98G和U251细胞,双荧光素酶报告系统鉴定lncRNA WARS2-IT与miR-299-3p,miR-299-3p与VEGFA的靶向作用关系。4.通过miR-299-3p的mimics和inhibitor转染T98G和U251细胞,采用划痕实验、CCK-8、EDU实验、Transwell、流式凋亡实验检测转染后对细胞増殖、侵袭、迁移、凋亡的影响。转染HBMVEC后观察血管生成情况的影响。5.回复实验进一步验证lncRNA WARS2-IT通过调控miR-299-3p/VEGFA轴发挥影响胶质瘤细胞功能表型的作用。结果:1.lncRNA WARS2-IT1主要表达在细胞质,作为miRNA的ce RNA调控肿瘤的发生发展。2.生物信息学分析显示miR-299-3p与lncRNA WARS2-IT1及VEGFA具有共同应答原件,并在胶质瘤组织及细胞中低表达。3.分别将miR-299-3p的mimics和inhibitor成功转染至T98G、U251细胞,双荧光素酶报告显示lncRNA WARS2-IT1与miR-299-3p,miR-299-3p与VEGFA的具有靶向调控作用。4.划痕实验、CCK-8、EDU实验、Transwell、流式凋亡结果显示,在转染miR-299-3p的mimics后,T98G和U251细胞増殖、侵袭、迁移能力受到明显的抑制并,促进了细胞凋亡,在脑胶质瘤中可以抑制HBMVEC成管能力。5.回复实验进一步证实lncRNA WARS2-IT通过调控miR-299-3p/VEGFA轴发挥影响胶质瘤细胞表型功能的作用。第四部分沉默lncRNA WARS2-IT1通过调控PI3K/AKT信号通路抑制胶质瘤增殖、侵袭和血管生成方法:1.构建沉默lncRNA WARS2-IT1表达的重组慢病毒载体稳转细胞株,Western-Blot检测VEGFA、CD34、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、caspase-3、caspase-7、BAX、BCL-2、MMP2、MMP9等蛋白的表达情况。2.使用Western-Blot蛋白检测方法,分别检测转染miR-299-3p的模拟物mimics,抑制物inhibitor后T98G和U251细胞中VEGFA、CD34、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、caspase-3、caspase-7、BAX、BCL-2、MMP2、MMP9等蛋白的表达情况。3.裸鼠皮下移植瘤实验使用慢病毒sh WARS2-IT1稳转细胞株进行皮下成瘤,并观察其对于裸鼠皮下成瘤能力,瘤体中VEGFA、CD34蛋白及血管数量的影响。结果:1.Western-Blot检测构建沉默lncRNA WARS2-IT1及过表达miR-299-3p后细胞株内VEGFA、CD34、P-PI3K、P-AKT、BCL-2、MMP2、MMP9等蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,PI3K、AKT蛋白表达水平未见明显影响,其中caspase-3、caspase-7、BAX等蛋白表达水平明显增加（P＜0.05）。2.裸鼠成瘤实验证实沉默lncRNA WARS2-IT1可以明显减小裸鼠皮下成瘤的肿瘤体积,减少VEGFA、CD34蛋白表达水平及肿瘤的血管数量（P＜0.05）。结论:1.lncRNA WARS2-IT1在胶质瘤组织中高表达;2.lncRNA WARS2-IT1促进胶质瘤增殖、侵袭、血管生成及成瘤能力;3.lncRNA WARS2-IT1可以抑制miR-299-3p分子水平,促进VEGFA蛋白表达,从而调控PI3K/AKT信号通路,进而促进胶质瘤增殖、迁移和HBMVEC血管形成能力。