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研究背景:华法林（Warfarin）是临床广泛使用的抗凝药物,主要包括心房颤动、瓣膜病、瓣膜置换术以及静脉血栓疾病的防治,并且对于人工瓣膜置换术患者具有不可替代性。三七为五加科植物三七的干燥根及根茎,具有活血化瘀等功效,三七总皂苷（Panax notoginseng saponin,PNS）为三七的主要有效成分。随着膳食补充剂的广泛应用,我们在临床工作中发现三七与华法林联用存在潜在相互作用,然而作为活血化瘀的中药,三七与华法林联用呈现拮抗作用,其机制如何,目前尚无相关研究报告。NR1I3是核受体超家族中的一员,在调控药物代谢方面的作用至关重要。有研究显示NR1I3作为CYP2C9的转录因子,而CYP2C9正是华法林的主要药物代谢酶。因此,在三七总皂苷对华法林药效及药代动力学的影响过程中NR1I3是否参与有待进一步研究。NR1I3是一种配体依赖性转录因子,经配体激活后去磷酸化并易位至细胞核,发挥转录调控作用。同时,除配体激活途径外,转录因子也存在micro RNA调控转录活性。然而,micro RNA作用于NR1I3是否参与三七总皂苷与华法林的药物相互作用仍待研究证明。本课题拟从药效、药代动力学、相关药物代谢基因等方面,对三七的主要活性成分三七总皂苷与华法林联用进行系统研究并揭示其中的作用机制,为华法林临床合理用药提供理论依据。第一部分三七总皂苷对华法林药效及药代动力学的影响目的:1.观察三七总皂苷对大鼠体内华法林药效、药代动力学及药物代谢酶的影响;2.观察在HepG2细胞中三七总皂苷对华法林药效及药物代谢酶的影响。方法:1.采用高效液相色谱质谱方法对三七总皂苷进行定性分析;2.建立高效液相色谱质谱联用（HPLC-MS/MS）方法,测定大鼠体内华法林的浓度。同时观察三七总皂苷联用华法林对凝血功能、凝血因子、血药浓度及相关药物代谢酶CYP2C9、CYP1A2、CYP3A4的影响。3.Elisa检测HepG2细胞中三七总皂苷对凝血因子的影响,Western Blot及qRT-PCR检测其对药物代谢酶的影响。结果:1.高效液相方法显示对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd可以实现很好的分离,并且所得的高效液相色谱图与国家药物标准品所收录的三七总皂苷色谱图图形一致,确定其为三七总皂苷。2.大鼠的体内实验结果表明:（1）三七总皂苷能够降低华法林的药效。与单用华法林组相比,联用组的国际标准化比值（INR）和活化部分凝血活酶时间（APTT）显著降低,凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ显著升高,且差异均具有统计学意义。（2）与单用华法林组相比,联用组的药时曲线下面积(AUC0-t)和平均驻留时间(MRT0-t)显著降低,表观分布容积（Vz/F）和清除速率（CLz/F）显著升高,且差异均具有统计学意义。（3）Western Blot及qRT-PCR结果显示,三七总皂苷对华法林的主要药物代谢酶CYP2C9及NR1I3呈明显诱导作用,而对CYP1A2、CYP3A4及华法林的作用靶点VKORC1无明显改变。免疫组化研究结果也同样证实了三七总皂苷对CYP2C9和NR1I3的诱导作用。3.细胞实验结果表明,与单用华法林组相比,联用组HepG2细胞中凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ显著升高。Western Blot及qRT-PCR结果显示,三七总皂苷对华法林的主要药物代谢酶CYP2C9及转录因子NR1I3呈明显诱导作用,差异具有统计学意义。结论:三七总皂苷通过诱导药物代谢酶CYP2C9加快华法林药物代谢并降低其药效。第二部分三七总皂苷诱导NR1I3影响华法林的药效及药代动力学目的:探讨NR1I3在三七总皂苷影响华法林药效及药代动力学的作用及机制。方法:1.细胞实验:构建NR1I3干扰及过表达的稳转细胞株,利用qRT-PCR和Western Blot检测干扰及过表达效果。细胞加药处理后,qRT-PCR和Western Blot检测干扰及过表达NR1I3后对药物代谢酶CYP2C9的影响。Elisa检测干扰及过表达NR1I3后凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ的变化。2.动物实验:构建干扰及过表达腺相关病毒注射病毒AAV9-NR1I3经尾静脉注射特异性感染大鼠肝脏组织,Western Blot和qRT-PCR验证感染效果。经给药处理后检测大鼠凝血功能、凝血因子的变化,HPLC-MS/MS检测华法林血药浓度及药代动力学参数的变化,qRT-PCR和Western Blot检测干扰及过表达NR1I3后对大鼠肝脏药物代谢酶CYP2C9的影响。结果:1.qRT-PCR和Western Blot结果显示HepG2细胞中干扰NR1I3后mRNA及蛋白水平明显降低,而过表达NR1I3后mRNA及蛋白水平明显升高。干扰NR1I3后,药物代谢酶CYP2C9表达下调,由于联用三七总皂苷导致的凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高有所下降,而在过表达NR1I3后,药物代谢酶CYP2C9表达升高,Elisa结果表明三七总皂苷导致的凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高更为显著,且差异具有统计学意义。2.qRT-PCR和Western Blot结果显示大鼠肝脏组织中干扰NR1I3后mRNA及蛋白水平明显降低,而过表达NR1I3后mRNA及蛋白水平明显升高。干扰NR1I3后,大鼠肝脏组织中药物代谢酶CYP2C9表达下调,由于联用三七总皂苷导致的INR和APTT降低、凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高得到部分回复。同时,大鼠体内华法林的药物浓度及药代动力学参数显示干扰NR1I3后华法林代谢减慢,并且由于联用三七总皂苷所导致的华法林代谢加快得到部分回复。过表达NR1I3后,大鼠肝脏组织中药物代谢酶CYP2C9表达升高,由于联用三七总皂苷导致的INR和APTT降低、凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高更为显著。同时,大鼠体内华法林的药物浓度及药代动力学参数显示过表达NR1I3后华法林代谢加快,并且由于联用三七总皂苷所导致的华法林代谢加快更为显著,差异具有统计学意义。结论:三七总皂苷通过诱导NR1I3影响华法林药效及药代动力学。第三部分三七总皂苷调控miR-214-3p/NR1I3影响华法林的药效及药代动力学目的:1.筛选出在三七总皂苷影响华法林药效及药代动力学中调控NR1I3的关键micro RNA。2.证明三七总皂苷通过调控miR-214-3p/NR1I3影响华法林的药效及药代动力学。方法:1.通过Target Scan在线预测软件,预测对NR1I3 mRNA 3’-UTR有潜在调控能力并且在肝脏中表达量较高的micro RNAs,进一步筛选可能调控NR1I3的micro RNAs。2.HepG2细胞经加药处理后检测micro RNAs的表达丰度变化,筛选出表达丰度降低的miR-214-3p。3.构建野生型（psi CHECK2-NR1I3-Wt）和突变型（psi CHECK2-NR1I3-Mut）报告基因质粒,利用双荧光素酶报告基因法证实miR-214-3p对NR1I3 mRNA3’-UTR的调控作用。4.构建miR-214-3p mimic及miR-214-3p inhibitor,分别转染HepG2细胞,加药处理后采用Elisa检测凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ的变化,Western Blot检测NR1I3及CYP2C9蛋白水平变化。5.在过表达NR1I3的HepG2细胞中同时转染miR-214-3p mimic,Elisa检测凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ的变化,Western Blot检测NR1I3及CYP2C9蛋白水平变化。6.在干扰NR1I3的HepG2细胞中同时转染miR-214-3p inhibitor,Elisa检测凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ的变化,Western Blot检测NR1I3及CYP2C9蛋白水平变化,回复实验进一步验证miR-214-3p对NR1I3的调控作用。7.HepG2经三七总皂苷加药处理后进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察NR1I3细胞定位的变化。结果:1.软件预测筛选出可能调控NR1I3的micro RNAs共4条:miR-214-3p,miR-125a-3p,miR-25-3p,miR-155-5p。2.HepG2细胞加药处理后,miR-214-3P表达丰度下降,miR-125a-3p表达丰度上升,差异具有统计学意义,miR-25-3p和miR-155-5p表达丰度无明显变化。3.双荧光素酶报告基因结果显示,过表达miR-214-3p可显著抑制psi CHECK2-NR1I3-Wt报告基因荧光素酶活性,差异具有统计学意义,而在NR1I3 mRNA 3’UTR miR-214-3p结合位点突变的报告基因系统（psi CHECK2-NR1I3-Mut）中,过表达miR214-3p对报告基因荧光素酶活性无影响。4.miR-214-3p mimic转染HepG2细胞后,与对照组相比,NR1I3及CYP2C9的蛋白水平下调,由于联用三七总皂苷导致的凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高得到部分回复。miR-214-3p inhibitor转染HepG2细胞后,与对照组相比,NR1I3及CYP2C9的蛋白水平上调,由于三七总皂苷导致的凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高更为显著,且差异具有统计学意义。5.在过表达NR1I3的HepG2稳转细胞株中转染miR-214-3p mimic后,由于过表达NR1I3导致的凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ升高得到部分回复,并且NR1I3和CYP2C9的蛋白水平上调也得到部分回复。6.在干扰NR1I3的HepG2稳转细胞株中转染miR-214-3p inhibitor后,由于干扰NR1I3导致的凝血因子Ⅱ和凝血因子Ⅹ下降得到部分回复,并且NR1I3和CYP2C9的蛋白水平下调也得到部分回复。7.免疫荧光结果显示,经三七总皂苷处理后,NR1I3激活并且进入细胞核增加,证明三七总皂苷对NR1I3的激活调控作用。结论:1.miR-214-3p靶向作用于NR1I3 mRNA 3’-UTR,两者存在调控关系。2.三七总皂苷调控miR-214-3p/NR1I3影响华法林的药效及药代动力学。