动物组织病料中病原核酸提取技术研究与应用

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近年来,我国面临的动物疫病防控形势十分严峻,外来动物疫病跨境传入风险极大。分子生物学技术以其快速、敏感、特异等优点而在动物疫病的检测、确诊工作中得到越来越多的应用。动物组织核酸(包括DNA和RNA)提取质量是影响后续物种的分子鉴定、疫病分子生物学诊断及病原分类鉴定的重要因素。动物检疫工作中,分子生物学检测方法的敏感性和特异性很大程度上决定于样品前处理环节(即核酸提取过程)。本论文拟开展动物组织病料中病原核酸提取技术研究,以满足口岸动物检疫核酸快速抽提以及实验室分子生物学精准检测的需求。本研究的内容主要包括以下四个部分:1、用酚抽提法、盐洗法和TriZol法等比较常规的核酸抽提方法及试剂盒方法提取核酸。2、在上述经典方法的基础上改进组装一种新的快速提取高质量核酸的方法。3、DNA提取应用实例:以派琴虫感染的阳性组织为模板,从组织液化、消化裂解细胞,最后纯化整个流程对裂解液配方及工艺进行优化。将这些技术筛选组装,确定DNA提取一步法组合,结合实时荧光定量PCR方法对所建立方法提取的DNA进行质量检测。4、RNA提取应用实例:以灭活的小反刍兽疫病毒和口蹄疫病毒细胞培养物为材料模板,结合二氧化硅柱纯化技术,利用实时荧光定量PCR技术检测所建立方法提取RNA的稳定性及灵敏性。综上所述,本研究开创性地建立了一种既能满足口岸快速检测需求,又能满足实验室精准检测技术要求的提取核酸的方法。而且在国内是首次开展适于口岸快速、高灵敏检测动物组织样品前处理技术的研究。本研究建立的动物组织病料核酸提取方法为临床应用及动物的疫病检测提供了广阔的发展空间。
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