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前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,发生转移后治疗难度加大,且预后不佳。因此,阐明PCa转移机制、识别高转移潜能前列腺癌的潜在诊疗靶点尤为重要。在本课题组前期工作中,我们选用前列腺正常上皮细胞,前列腺癌细胞PC-3和前列腺癌高转移细胞PC-3M通过噬菌体七肽库进行差减筛选,得到了只与PC-3M特异性结合的短肽B04,并且证实B04能够有效抑制PC-3M细胞的增殖、转移。随后,通过蛋白质组学等方法检测到了短肽B04的受体蛋白为PC-3M细胞膜上的ATP5B,并验证了ATP5B在PC-3M细胞的细胞膜异位表达。ATP5B通常表达于线粒体内膜,在某些细胞中可以异位表达于细胞膜,其功能并未明确。异位表达于PC-3M膜表面的ATP5B的功能有待鉴定,因此在本实验中,我们旨在发现和探究ATP5B在细胞膜异位表达对人前列腺癌细胞侵袭转移能力的影响及其机制。实验结果:1.ATP5B在前列腺癌及癌旁组织的表达及定位通过免疫组化染色法检测98例前列腺癌组织芯片中ATP5B蛋白的表达情况,前列腺组织芯片包括58例前列腺癌组织、37例前列腺癌旁组织和3例正常前列腺组织。并对ATP5B在细胞膜异位表达情况进行分析,结果显示:(1)ATP5B在前列腺癌组织中可出现肿瘤细胞膜的异位表达;且细胞膜异位表达阳性率在浸润扩散的前列腺癌组织中明显增高(p<0.05)。(2)ATP5B在细胞膜异位表达阳性率在Gleason≥8的前列腺癌组织中明显增高(p<0.05)。2.ATP5B在细胞膜异位表达对前列腺癌细胞侵袭转移能力的影响⑴细胞膜ATP5B过表达与抑制表达的模型建立分别用胆固醇和白皮杉醇处理PC-3M细胞,采用Western blot、实时定量PCR、ATP水平检测等技术从蛋白、基因和功能水平探究胆固醇和白皮杉醇对于PC-3M细胞膜ATP5B的表达是否有影响。结果显示:(1)蛋白水平:胆固醇处理后PC-3M的线粒体蛋白ATP5B降低,膜蛋白ATP5B增加,总蛋白ATP5B无明显变化;白皮杉醇处理后PC-3M的线粒体蛋白ATP5B无明显变化,膜蛋白ATP5B降低,总蛋白ATP5B降低,(2)基因水平,胆固醇处理PC-3M后,ATP5B m RNA相对表达量无明显变化;白皮杉醇处理PC-3M后,ATP5B m RNA相对表达量降低。(3)功能水平,胆固醇促进PC-3M细胞外ATP生成,白皮杉醇抑制细胞外ATP生成。以上结果提示,胆固醇促使ATP5B由线粒体异位至细胞膜,增加细胞膜ATP5B的表达;而白皮杉醇可以抑制细胞膜ATP5B的表达。⑵ATP5B在细胞膜异位表达促进前列腺癌侵袭转移的体内外研究采用细胞划痕实验、Transwell小室迁移/侵袭实验来检测改变ATP5B在细胞膜异位表达量后,PC-3M的侵袭转移功能在体外的改变。结果显示:胆固醇处理PC-3M后,ATP5B在细胞膜异位表达量增高,其体外迁移、侵袭均提高(p<0.05);细胞膜ATP5B抑制剂白皮杉醇处理PC-3M后,其体外迁移、侵袭均明显下降(p<0.05)。随后采用人前列腺癌鸡胚绒毛尿囊膜转移模型检测抑制细胞膜ATP5B表达前后PC-3M半体内转移能力变化。结果显示:抑制PC-3M细胞膜ATP5B,其转移能力明显下降(p<0.05)。以上结果提示ATP5B在细胞膜异位表达可促进前列腺癌侵袭转移。⑶ATP5B在细胞膜的异位表达促进前列腺癌侵袭转移机制初步探索采用Westren Blot、PCR检测改变ATP5B在细胞膜异位表达量后,c-Myc、VEGFA的蛋白以及m RNA的变化。结果显示:ATP5B在PC-3M细胞膜异位表达量的改变会引起c-Myc、VEGFA蛋白及转录水平的变化,并且改变ATP5B在细胞膜的异位表达量后其体外诱导HUVEC细胞管型形成的能力也随之发生变化。推测:ATP5B在细胞膜异位表达可能通过激活c-Myc原癌基因并上调VEGFA来促进前列腺癌的侵袭转移。以上实验结果说明了ATP5B在高级别前列腺癌和浸润扩散的前列腺癌组织的细胞膜上高表达;可分别通过胆固醇和白皮杉醇处理PC-3M细胞来构建细胞膜ATP5B过表达和抑制表达模型;ATP5B在细胞膜异位表达促进前列腺癌细胞体内外侵袭转移,其机制可能是通过激活C-Myc原癌基因并上调VEGFA来促进前列腺癌的侵袭转移。以上结果也进一步说明ATP5B在细胞膜异位表达可促进前列腺癌细胞的侵袭转移,有望成为前列腺癌转移的检测指标或治疗靶点。