研究背景：甲状腺乳头状癌是甲状腺癌最常见的病理类型(约占80%),近年来世界各地均出现甲状腺癌的发病率持续升高的现象,其中尤以甲状腺乳头状癌发病率的上升最为明显。研究表明,甲状腺乳头状癌是一种“隋性”肿瘤,其早期诊断和及时的手术治疗可以明显改善患者预后,有效降低复发率和病死率。目前公认的甲状腺癌的诊断方法是超声及超声引导下细针穿刺活检(FNAB),但是超声诊断的缺陷在于其结果依赖于检查者的个人技术水平,而FNAB的诊断灵敏度和特异性也并不尽人意,尤其是甲状腺微小癌(癌灶直径<1cm)的FNAB阴性预测准确率只能达到72.2%。因此有很多研究者致力于找到有效的生物标志物来辅助FNAB的诊断,提高甲状腺癌术前诊断的准确率,避免非必要的手术治疗给患者带来的焦虑情绪和身体创伤。代谢组学是一种利用分析化学方法来研究一个代谢物组中小分子代谢相关物质及其变化规律的科学。它能够及时而全面的分析出生物系统在某一特定阶段存在的复杂的代谢物质,并能对这些物质进行定性以及定量的检测,反映内外因变化对系统代谢造成的影响。目前它已成为一个公认的系统分析平台,可用于组织、血液、尿液等生物样本的研究,揭示其中小分子代谢物的组成特点及变化规律。根据研究模式不同,可将代谢组学分为非靶标代谢组学和靶标代谢组学。非靶标代谢组学是从全局分析的角度将样本中所有的代谢物质识别出来,该研究模式的优势在于全面寻找有差异的代谢物,可用于诊断标志物的初步筛查；其缺点是对代谢物识别的准确性不高,可信度较低,且只能进行半定量测定。而靶标代谢组学的特点则是利用相应的标准品对既定的一组代谢物质进行精确的定性定量分析,其准确性和重现性远高于非靶标代谢组学。两者互相结合可以各取所长,使得代谢组学研究结果更加完善。随着生物信息技术的发展,越来越多的平台被开发出来用于代谢组学相关研究,包括气相色谱-质谱分析(GC-MS)、液相色谱-质谱分析(LC-MS)和核磁共振谱学分析(NMR)等。因此笔者认为代谢组学研究可以为寻找肿瘤标志物及探索肿瘤发生发展过程中的代谢紊乱提供新的研究方向。研究目的：我们本次研究的目的是希望利用靶标和非靶标代谢组学相结合的方式探索甲状腺乳头状癌的代谢特点。首先利用气相色谱-飞行时间-质谱(GC-TOF-MS)平台找到针对甲状腺乳头状癌组织进行代谢组学分析的实验方法；其次通过非靶标代谢组学的研究模式初步比较分析甲状腺乳头状癌组织样本和正常甲状腺组织样本,评价该方法的应用效果,找到含量有差异的代谢物质；进而探索出利用超高效液相色谱-三重四级杆-质谱(UHPLC-QqQ-MS) 和 GC-TOF-MS对肌醇半乳糖苷(galactinol)和蜜二糖(melibiose)等标志物进行测定的方法。最后通过靶标代谢组学的模式进行验证实验,对筛选出的标志物进行精确定性和绝对定量分析,并根据定量结果分析标志物的诊断价值,以期找到可用于辅助FNAB诊断的生物标志物。从而提高甲状腺乳头状癌的术前诊断准确率,使患者能够被早诊断早治疗,同时减少患有非恶性甲状腺结节患者的过度焦虑情绪,避免不必要的手术治疗。此外,我们还可以通过对受影响的代谢通路的分析,研究甲状腺乳头状癌的发生发展机制,探索其潜在的治疗靶点。研究方法：1.临床样本的收集。甲状腺乳头状癌及正常甲状腺组织来源于甲状腺手术患者(2013.12.1-2014.12.31,山东省立医院乳腺甲状腺外科)的术中样本,共收集了50个样本,其中包括25个术后病理证实为甲状腺乳头状癌组织样本和25个正常甲状腺组织样本。2. 非靶标GC-TOF-MS代谢组学分析。共30个样本(15个甲状腺乳头状癌组织vs15个正常甲状腺组织)用于非靶标代谢组学分析。通过研磨,离心,提取等步骤,将组织中的代谢物质分离,加入内参标准品L-2-氯苯丙氨酸后放入GC分析仪。GC分析柱中可将各组分根据分子量不同进行分离,分离出的物质依次进入TOF-MS进行各组分的质量(mass)和保留时间(R.T.)测定。将数据与数据库中的代谢物信息进行比对,得出代谢物的定性及半定量结果。3. 非靶标GC-TOF-MS统计学分析。原始数据经过缺失值模拟,最小值二分之一法进行填补,数据过滤去噪,内标归一法处理后导入SIMCA-P+ 13.0软件进行模式识别分析。模式识别分析方式包括主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),另外为评估PLS-DA模型的稳定性和预测能力我们进行了7折交叉验证实验。最后基于OPLS-DA模型,进行差异代谢物分析,筛选标准是变量投影重要性(VIP)大于1.0且t检验结果P值<0.05。用于代谢物相关通路分析的数据库是京都基因和基因组百科全书(EGG; http://www.genome.jp/kegg/)。4.靶标UHPLC-QqQ-MS分析和数据处理。共有20个样本(10个甲状腺乳头状癌组织vs 10个正常甲状腺组织)用于靶标分析。所有的分析物标准品经过甲醇或蒸馏水稀释配成具有浓度梯度的标准溶液(10 ng/μl至100 ng/μl)。进入多反应监测系统(MRM)的模式(阳离子模式或阴离子模式),优化参数去簇电压(DP),碰撞能(CE)和碰撞通道输出加压值(CXP)的检测值,选择代谢物质谱检测响应值最高的参数模式。样本经过预处理后进入UHPLC分析仪进行色谱分析,然后进入QqQ-MS得到最终结果。根据梯度标准品溶液测定结果绘制标准曲线,确定定量结果。T检验用来分析两组间某一代谢物的统计学差异,另外利用R语言软件绘制受试者工作曲线(ROC curve)来评价各个独立的生物标志物和多个标志物联合的诊断效果。5.靶标GC-TOF-MS分析和数据处理。所有的分析物标准品经过甲醇或蒸馏水稀释配成具有浓度梯度的标准溶液(10 ng/μl100 ng/μl)。与靶标UHPLC-QqQ-MS分析同样样本共20个(10个甲状腺乳头状癌组织vs 10个正常甲状腺组织),经过预处理(过程与非靶标分析一样)包括衍生化过程,进入GC分析仪,然后进入与之偶联的TOF-MS。将待测物相关参数与相应的标准曲线进行比对,得到最终的定量结果。统计学分析过程与UHPLC-QqQ-MS相同。结果：1.我们探索出利用GC-TOF-MS技术平台对甲状腺乳头状癌组织样本进行分析的具体实验方法,弥补了之前没有用这一平台进行甲状腺癌组织样本研究的不足。通过非靶标的GC-TOF-MS分析得到全部样本的代谢图谱分析结果。基于色谱分析过程,我们得到所有样本的总离子色谱图(TICs),图中的各个色谱峰没有漂移现象证明了各组分在色谱柱中保留时间的稳定性。全部样本分析后,共有761个色谱峰被识别出来,去除噪音数据后最终得到686个代谢物信息。2.统计学模式识别分析发现GC-TOF-MS可以将甲状腺乳头状癌样本和正常甲状腺组织样本区别开。首先,PCA计算的结果是R2X=0.427、Q2=0.159,PCA得分图结果表明所有的样本都可以被清晰地区分,且无不相关的离群样本。其次,针对某些样本没能被清楚分组的情况,我们采取有监督的方式对数据进行分析,PLS-DA模型计算的结果是R2X=0.225和R2Y=0.944,证明了该模型中数据的稳定性和模型参数的高度适应性,得分图显示出两组样本区分明显。同时对PLS-DA模型进行7折交叉排列验证实验,结果排除了该模型中数据的随机效应。最后,我们用OPLS-DA模型将癌组织组和正常组精确区分开来,结果R2X=0.225, R2Y=0.944, Q2Y= 0.687,这表明该组数据的差别主要来自组间的差异。3.统计学分析发现组间含量有差异的代谢物共45个,与之相关的受疾病影响的代谢通路有15个。基于OPLS-DA模型,我们筛选癌组织组和正常组之间含量有差异的代谢物,标准是VIP值>1且P值<0.05。差异倍数较明显的代谢物包括α-氨基乙二酸(alpha-aminoadipic acid;差异倍数(FC)=20.05),α-亚麻酸(a-linolenic acid; FC=4.176)等。通过KEGG数据库匹配到的受影响的代谢通路中,半乳糖代谢(Galactose metabolism)是受影响最大的代谢通路,其包含的差异代谢物数量最多,包括葡萄糖(Glucose).山梨醇(Sorbito 1).肌醇半乳糖苷(Galactinol)和蜜二糖(Melibiose)。其他受影响的代谢通路还包括赖氨酸降解(Lysine degradation),配体受体神经信号传导通路(Neuroactive ligand-receptor interaction),嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism),不饱和脂肪酸的合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)以及双组分信号转导系统(Two-component system)。参与这些通路的差异代谢物包括油酸(Oleic acid)、去甲肾上腺素(Noradrenaline)、花生酸(Arachidic acid)、α-氨基乙二酸(alpha-Aminoadipic acid)、戊二酸(Glutaric acid)、α-α-亚麻酸(Linolenic acid)、尿甘(Uridine)、5,6-二氢尿嘧啶(5,6-Dihydrouracil)和褪黑素(Melatonin)共9个。与半乳糖代谢通路中的4个代谢物结合起来共13个代谢物进入后续靶标代谢组学研究。4.靶标代谢组学实验验证出11个代谢物质,经过统计学分析,其中3个可作为潜在诊断标志物。我们构建了标准曲线用于待验证代谢物质的定量分析,除glucose, glutaric acid 和 noradrenaline以外,其它的标准曲线的参数R2均大于0.98。除去noradrenaline 和 5,6-dihydrouracil以外,共有11个代谢物质在样本中得到验证,即它们具有较高的被测灵敏度及检测可重复性。经过t-检验,我们发现只有参与galactose metabolism通路的galactinol, melibiose和参与neuroactive ligand-receptor interaction通路的melatonin在甲状腺乳头状癌组织和正常甲状腺组织之间存在统计学差异(P<0.05),可以作为诊断标志物进行后续研究。5.将galactinol, melibiose 和 melatonin作为联合标志物对于甲状腺乳头状癌的诊断效率最高。我们构建ROC曲线计算曲线下面积(AUC)以研究三个标志物的诊断效果。首先,分别构建三个标志物的ROC曲线,发现无论是利用非靶标的半定量数据还是靶标实验的定量数据,除galactinol以外,其他两个指标的AUC值均小于0.9。其次,我们将三个指标联合起来研究,基于非靶标数据显示联合标志物的诊断灵敏度为93.3%,特异性为100%,AUC值为0.95。通过分析靶标实验的数据,进一步证明了联合标志物诊断的优势：灵敏度90.0%,特异性100%,AUC值0.96。6. Galactose metabolism通路参与甲状腺乳头状癌发生发展过程。为了分析与甲状腺乳头状癌相关性最大的代谢通路,我们利用Metabo Analyst 2.0 (http://www.metaboanalyst.ca/Metabo Analyst/)分析差异代谢物,数据表明半乳糖代谢通路的影响值为0.1,即该代谢通路显著影响乳头状癌的肿瘤发生发展过程。通过KEGG数据库中的半乳糖代谢通路图,我们发现α-半乳糖苷酶(GLA)是影响半乳糖代谢的关键酶之一。同时,我们的实验结果证明通路中的甘露糖(mannose), sorbitol, galactinol, melibiose 和 glucose均是GLA对半乳糖进行分解得到的产物,且它们的含量在癌组织中均较低。因此,我们推测甲状腺乳头状癌组织中GLA的活性降低或受到抑制可能是相关降解产物含量降低的原因,通过改变它的活性也可能成为甲状腺乳头状癌后续治疗研究中的有效靶点。结论：1.本次研究首次探索出非靶标和靶标代谢组学联合研究甲状腺乳头状癌辅助诊断标志物的方法。这种筛选加验证的方法对标志物进行精确定性和定量分析,使筛选出的标志物具有更高的准确性和可重复性,有效提高了其临床应用价值。这是首次将靶标代谢组学的方法应用于甲状腺癌标志物研究。2.本次研究创造性得探索出利用非靶标GC-TOF-MS和靶标GC-TOF-MS, UHPLC-QqQ-MS平台对甲状腺乳头状癌组织样本进行分析的具体实验方法。并且证明了GC-TOF-MS平台可用于甲状腺乳头状癌组织样本和正常组织样本的判别诊断。3.代谢物图谱易受机体内外多方面因素的影响,是代谢组学分析的特征之一,本次研究专门针对甲状腺乳头状癌这一最常见甲状腺癌病理学类型进行分析,可以排除由于病理类型不同而对代谢图谱造成的干扰。利用组织样本进行研究可以最直接得反映病灶本身代谢相关变化,为肿瘤形成机制的研究提供可靠线索。4.由于代谢系统的复杂性,我们特别提出利用联合标志物辅助甲状腺乳头状癌诊断。通过我们的研究,galactinol,melibiose 和 melatonin三种代谢物作为联合标志物被提出来用于辅助诊断。5.代谢物富集分析得出的受影响的代谢通路的结果提示影响甲状腺乳头状癌发生发展的因素。Galactose metabolism通路作为人体能量代谢的一部分在甲状腺乳头状癌的发生发展中起到重要作用。我们提出该通路中的关键酶的GLA可能作为新的治疗靶点用于今后的研究。