PTEN对Burkitt淋巴瘤的抑制作用及其机制探讨

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伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma,BL)是一种来自生发中心的高侵袭性B细胞淋巴瘤。短期疗程及高剂量联合化疗可显著提高儿童Burkitt淋巴瘤患儿的治愈率。然而,成人及晚期患者,特别是40岁以上的患者,往往会浸润中枢神经系统,化疗副反应多且重,预后欠佳,因此有必要寻找低毒有效的治疗方法。很多研究表明PTEN异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关。探索PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞株CA46细胞和RAJI细胞有何生物学特性影响和作用机制,揭示PTEN与Burkitt淋巴瘤发生发展的关联性,为Burkitt淋巴瘤的临床诊疗开发新的抗肿瘤药物和寻找新的基因靶向治疗提供新的思路。本课题的研究主要分以下三个部分:第一部分PTEN过表达和沉默重组慢病毒载体的构建目的:构建慢病毒载体,为慢病毒感染Burkitt淋巴瘤细胞做准备。方法:1、通过PCR获取PTEN c DNA及设计合成PTEN-sh RNA序列;2、PTEN c DNA/PTEN-sh RNA与载体PLV-CMV-FLAG/载体PLKO.1-PURO经过相同限制性内切酶酶切后连接;3、连接产物转化;4、质粒小提后通过酶切及测序验证PLVCMV-FLAG-PTEN载体/PLKO.1-sh PTEN载体;5、PTEN-sh RNA通过Lipofectamine LTX转染Burkitt淋巴瘤细胞,提取细胞总蛋白,Western blot验证沉默效率,选取沉默效率较低的序列进行后续病毒包装。结果:1、通过酶切和测序验证PTEN过表达重组慢病毒载体质粒PLV-CMV-FLAGPTEN构建成功;2、通过酶切和测序验证PTEN沉默重组慢病毒载体质粒PLKO.1-PURO-sh PTEN构建成功,并筛选出沉默效率较高的PLKO.1-PURO-sh PTEN#1、PLKO.1-PURO-sh PTEN#2进行后续病毒包装。结论:成功构建了PTEN过表达和沉默载体质粒。第二部分PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株的建立目的:筛选出PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株,为探索PTEN对Burkitt淋巴瘤生物学行为的影响做准备。方法:1、通过三质粒共转染293FT包装慢病毒;2、超高速离心法浓缩慢病毒;3、流式细胞术及Real-time PCR测定病毒滴度;4、慢病毒感染CA46和RAJI细胞后经过puromycin筛选稳定细胞株;5、通过荧光显微镜观察EGFP蛋白表达情况、Real-time PCR检测PTEN m RNA表达水平、Western blot检测PTEN蛋白表达水平,从而验证稳定株是否筛选成功。结果:1、成功包装PTEN过表达和沉默慢病毒,并完成病毒滴度测定;2、通过荧光显微镜观察到EGFP表达、Real-time PCR检测出PTEN过表达组PTEN m RNA表达上调、Western blot检测出PTEN过表达组PTEN蛋白表达上调;3、通过Realtime PCR检测出PTEN沉默组PTEN m RNA表达下调、Western blot检测出PTEN沉默组表达水平下调。结论:成功筛选出PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株。第三部分PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的影响及机制目的:初步探索PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的影响及机制。方法:1、采用CCK-8法分析PTEN对CA46细胞和RAJI细胞生长增殖的影响;2、Hoechst 33342与PI双染法检测PTEN对CA46细胞和RAJI细胞凋亡的影响;3、流式细胞术分析PTEN对CA46细胞和RAJI细胞周期分布的影响;4、Transwell小室检测PTEN对CA46细胞和RAJI细胞迁移和侵袭能力的影响;5、Western blot技术检测各组CA46细胞和RAJI细胞中与PTEN/AKT信号通路、细胞周期、迁移和侵袭相关蛋白的检测,分析PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞生物学特性影响的机制。结果:1、PTEN下调pAKT表达抑制Burkitt淋巴瘤细胞增殖;2、PTEN上调Bad、Bax诱导Burkttt淋巴瘤细胞凋亡;3、PTEN上调P53、P21的表达,下调CDK4、CDK6、Cyclin D3、Cyclin H的表达,阻滞Burkitt淋巴瘤细胞周期进程;4、PTEN上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin、β-catenin、TCF-8、Vimentin、Slug、Snail的表达,抑制Burkitt淋巴瘤细胞的迁移和侵袭;5、沉默PTEN促进Burkitt淋巴瘤细胞增殖、迁移并加速细胞周期进程。结论:PTEN能够抑制Burkitt淋巴瘤细胞的增殖和迁移侵袭,诱导细胞凋亡与周期阻滞。综上,PTEN在Burkitt淋巴瘤发生发展过程中发挥着重要的抑制作用,从而有希望成为治疗Burkitt淋巴瘤的临床靶标。
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