复合菌剂强化对大曲中土味素抑制作用研究

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链霉菌与其特征性代谢产物土味素(geosmin,GSM)造成的污染一直是白酒行业中严重的污染问题。大曲作为白酒酿造的重要原料,其制作过程中检测到了较高的土味素含量。土味素阈值极低,大曲中土味素含量高于5μg·kg-1时就会导致白酒中出现明显泥土异味,严重破坏白酒的风味和品质。大曲中微生物种类、含量丰富,且大曲制作过程是在开放、复杂的环境中进行的,在这种复杂条件下实现对微克级别化合物土味素的精准调控存在困难。本课题从酿造微生态的角度出发,利用微生物之间可能存在的拮抗作用,探究对链霉菌有抑制作用的微生物。通过设计多菌株复配的生物防治方案,从源头抑制大曲中链霉菌与土味素含量,并达到大曲生产可控,品质可控的目的。本研究以中温大曲为研究对象,选择白色链霉菌(Streptomyces albus)FXJ作为链霉菌属的代表微生物开展研究。借助顶空-固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)测定大曲中土味素与其他挥发性风味化合物的含量,采用实时定量PCR(q PCR)技术定量分析大曲中链霉菌的生物量,并结合微生物组学研究方法对大曲的微生物结构进行了分析。本研究突出了生物防治作为一种环境友好的方法对复杂体系中微克级别化合物的精准调控能力,并突出了实现复杂微生物群落精准调控的可能性。取得的主要研究成果如下:(1)首先明晰了两个受土味素污染最严重的白酒厂大曲中土味素的含量情况,基于从中温大曲中分离出的微生物对链霉菌的抑制作用得到毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母属(Saccharomyces sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)共6株微生物,经过复配后作为土味素抑制菌剂应用于大曲实际生产中。通过土味素含量、理化指标和挥发性风味化合物变化情况分析了土味素抑制菌剂在大曲中的应用效果。结果表明,两个酒厂中土味素含量均超过5μg·kg-1,新酒中出现明显的泥土异味。土味素抑制菌剂干预结果表明,土味素抑制菌剂有效降低了大曲中的土味素含量,大曲制作结束时,土味素含量均低于5μg·kg-1,最大浓度消减比例为54.6%;大曲的液化力、糖化力和酯化力分别提高13.5%、25.7%和69.7%;同时显著提升了大曲中挥发性风味化合物如1-己醇、乙酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、庚醇、2-甲基丁酸乙酯、苯乙醇、己醛和3-甲基丁醛的含量。因此,我们认为土味素抑制菌剂在应用效果层面对大曲存在正向影响。(2)其次解析了土味素抑制菌剂干预对大曲微生物群落结构的影响。基于q PCR分析表明,土味素抑制菌剂干预有效降低了大曲中链霉菌的生物量。通过微生物组学的手段揭示了大曲制作过程中微生物群落多样性与结构,解析了土味素抑制菌剂发挥作用的时间与主要作用位置。土味素抑制菌剂中的Pichia和Saccharomyces主要在制曲前期发挥作用,而Bacillus主要在制曲后期发挥作用,土味素抑制菌剂在曲皮中有更显著的作用效果。主成分分析(Principal-component analysis,PCA)和置换多元方差分析(Permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)表明,土味素抑制菌剂可以在不破坏大曲原有的微生物群落结构的情况下,通过调控对链霉菌有抑制作用的微生物的含量,达到针对土味素的精准调控的目的。微生物群落相关性网络分析表明,微生物的含量可能对菌群相互作用的形成有更大的影响。(3)最后,在土味素抑制菌剂的实际应用中,发现大曲中土味素的抑制效果还有进一步的提升的可能。研究发现含水量是影响大曲中土味素含量的关键因素。针对制曲后期含水量下降至10%-20%,而土味素含量出现了二次增长的现象,提出了针对低含水量条件下的新的菌株复配思路。结合Spearman等级相关性分析与可培养实验得到了在低含水量条件下对链霉菌有抑制作用的霉菌。测定其在低含水量条件下生长的能力和在低含水量条件下模拟培养时对土味素的抑制效果。其中两株微生物分别为曲霉属(Aspergillus sp.)和根霉属(Rhizopus sp.)表现出最强的土味素抑制能力,土味素浓度消减比例最高可达91.06%(P<0.001)。
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