肝肺综合征（Hepatopulmonary Syndrome，HPS）是一种与肝病有关的肺血管扩张所致的以动脉氧合下降为主要表现的临床综合征。其病理基础是肺血管扩张。其发病机制尚不明确，但大多认为是扩血管因子一氧化氮（nitric oxide NO）产生过多造成的。　　 NO是由一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）以L一精氨酸为底物催化而成，NOS有三种异构体形式，即神经原型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS）。其中eNOS和nNOS又合称为原生型（constitutiveNOS，cNOS），主要存在于内皮细胞、神经细胞和血小板等，诱导合成正常生理需要量的NO。而iNOS主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞、免疫细胞等。正常状态下细胞内iNOS表达水平较低，经细胞因子及内毒素等诱导，iNOS表达增多。iNOS的作用时问长，可催化生成大量NO。iNOS的表达是一个复杂的过程，许多翻译前及翻译后因素参与其中，包括TNF-α在内的多种致炎因子和/或细胞因子，均可刺激iNOS的转录。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一种促炎性细胞因子，在免疫反应、炎症和对损伤反应中起重要作用，主要影响细胞增殖和细胞凋亡的调节，不仅对肿瘤细胞有细胞毒/细胞溶解、抑制增殖、诱导细胞凋亡等作用，还影响多种正常细胞的生长分化，并与其他细胞因子一起形成复杂的免疫网络。TNF-α主要是由单核-巨噬细胞分泌，其他类型的细胞如淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等在一定条件下也具有产生和释放TNF-α的能力。　　 肝肺综合征在肝硬化患者中的发病率为10％-30％。目前，肝肺综合征最有效的治疗方法为肝移植，但由于肝源的有限性，使很多患者不能得到及时的治疗。因此，肝肺综合征药物治疗的研究尤为重要。有研究表明TNF-α抑制剂己酮可可碱在HPS大鼠模型中实验可以减少NO的形成量，因此受到启发TNF-α单克隆抗体是否可以阻断此信号传导通路呢，而且目前TNF-α单克隆抗体已应用于类风湿关节炎、糖尿病、心肌炎等炎症性疾病的治疗。本实验采用TNF-α单克隆抗体对大鼠肝肺综合征模型进行实验性治疗，以便为HPS的临床治疗提供理论基础。　　 目的：制作大鼠肝肺综合征动物模型，通过腹腔注射肿瘤坏死因子-α单克隆抗体，研究抑制TNF-α表达后NO、iNOS的表达的影响以及肺功能的变化。　　 方法：采用胆总管结扎（common bile duct ligation，CBDL）大鼠肝肺综合征模型，将60只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组和干预组。模型组分别于结扎后1wk、2wk、3wk、4wk、5wk麻醉动物，干预组于结扎后第2周开始腹腔注射肿瘤坏死因子-α单克隆抗体（0.1mg/kg/2d）于干预后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉动物，假手术组与5wk模型组动物同批麻醉，留取肝组织、肺组织、血标本。采用HE染色确定模型建立情况，Masson三色染色观察肝硬化形成情况及干预组与模型组的对比；通过检测血气分析、NO来了解肺功能的变化；免疫组织化学方法检测iNOS在HPS形成过程不同时期及干预后不同时期肺组织中分布及含量的动态变化；采用Western blot及RT-PCR方法分别检测iNOS在HPS形成及干预过程中肺组织中mRNA及蛋白表达情况。　　 结果：　　 1、肝脏及肺脏病理改变　　 CBDL组肝脏病理HE及Masson染色显示肝脏小胆管广泛增生，胆管扩张，纤维组织增生，假小叶形成。干预组大鼠肝脏HE染色显示小叶结构变化不明显，小胆管仍有增生；Masson染色显示门管区胶原纤维轻微增多，未见假小叶形成。假手术组HE染色肝小叶结构完整，肝板排列整齐；Masson三色染色仅在门管区可见少量结缔组织。　　 CBDL组肺脏HE染色显示大鼠肺脏肺泡隔增宽，肺间质内炎症反应明显，可见巨噬细胞。肺间质毛细血管密度有所增加，提示肺间质血管扩张、充血，部分区域的肺泡腔略变小。干预组肺脏毛细血管轻度扩张，肺泡间隔轻度增宽。假手术组肺泡呈半球形的小囊，肺泡壁薄，相邻肺泡之间可见由薄层结缔组织构成的肺泡隔，肺泡内有连续的毛细血管和弥散存在的肺巨噬细胞。　　 2、肝功能检测：　　 血浆ALT及TBIL在CBDL术后造模组1周明显增加，与Sham组比较P<0.05，有明显差异。之后虽逐渐下降，但均明显高于Sham组。TNF-α单克隆抗体干预治疗后1周即较同周CBDL组明显下降，P<0.05，有明显差异。之后，呈下降趋势，但仍明显高于Sham组。　　 3、血浆TNF-α检测：　　 CBDL术后1周血浆TNF-α水平即明显升高，之后呈上升趋势，3周时血浆TNF-α水平达高峰，4周时有所回落，5周又开始回升，但均明显高于Sham组。TNF-α单克隆抗体干预治疗后1周即开始明显降低，之后继续下降，至干预治疗后4周仍高于同周Sham组。　　 4、动脉血气分析检测：　　 CBDL造模2周肺泡-动脉氧分压梯度差P（A-a）O2开始出现增大，与Sham组比较P<0.05，有明显差异。之后呈上升趋势。TNF-α单克隆抗体干预治疗后2周较CBDL术后同周组开始下降，之后呈下降趋势，至3周P（A-a）O2与同周CBDL组比较P<0.05，有明显差异。但仍明显高于Sham组。　　 5、NO检测结果：　　 术后1周NO开始上升，与Sham组比较P<0.05，有明显差异。至3周末达到高峰后呈下降趋势，但均明显高于Sham组。TNF-α单克隆抗体干预治疗后1周即开始明显降低，之后继续下降，至干预治疗后3周仍高于Sham组，但无明显差异。　　 6、肺组织iNOS的表达　　 免疫组织化学结果显示，CBDL组iNOS蛋白阳性表达较多，可见细胞胞浆呈棕褐色细颗粒，阳性表达细胞多集中于吞噬细胞胞浆中；与Sham组比较P<0.05，有明显差异。TNF-α单克隆抗体干预后iNOS蛋白表达下降，表现为阳性着色变少，但均明显高于Sham组。　　 Western blot分析iNOS蛋白表达，在130KD的位置上出现杂交带，从杂交信号强度可知，CBDL术后造模组1周肺组织iNOS蛋白表达即开始明显增加，与Sham组比较P<0.05，有明显差异。至2周达高峰，之后又下降，并在一定范围波动。TNF-α单克隆抗体干预治疗后1周开始明显下降，与同周CBDL组比较，P<0.05，有显著性差异；至干预后3周末与同周CBDL组有明显差异，p<0.05；但与Sham组无明显差异，p>0.05。　　 RT-PCR扩增检测iNOS mRNA表达实验结果与上述两种方法结果一致。　　 结论：　　 1、进一步证实了在肝肺综合征的形成过程中，肝脏功能改变是肺功能变化的基础。　　 2、肝硬化动物HPS的发生与TNF-α密切相关。　　 3、iNOS源性NO是HPS形成机制中重要的因子。　　 4、应用TNF-α单克隆抗体干预治疗，可通过中和血浆TNF-α，部分降低血浆TNF-α水平、iNOS蛋白表达，NO生成减少，从而部分改善HPS的严重程度。