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SIRT6是Sirtuin家族中的一员,具有去乙酰化酶活性和单ADP核糖基转移酶活性。在人和小鼠上的研究表明SIRT6是细胞及个体上调控衰老及寿命的关键基因,参与端粒维护、DNA损伤修复、糖代谢、脂代谢等多项生理活动。但目前尚未有关于水牛SIRT6基因功能的报道。本研究对SIRT6在水牛成纤维细胞衰老上的功能及作用进行了初步探讨,为水牛供体的选择与培养,水牛及相关大型动物基因保护,衰老机制的探讨等,提供实验基础以及理论依据。实验首先克隆了水牛SIRT6基因编码区,探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖、衰老表型、DNA损伤位点和SIRT6基因相对表达量等差异。结果表明,获得水牛SIRT6基因编码区序列全长1080bp,可编码359个氨基酸,其中亮氨酸及脯氨酸含量(10.3%)最高,酪氨酸含量(1.1%)最低。水牛SIRT6核酸序列与牛,人序列相似性分别为98.4%,85.9%,含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构;通过对水牛SIRT6组织表达谱分析,结果表明SIRT6在心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、脑、生殖嵴、皮肤中均有表达,生殖嵴中表达量最高,皮肤与心脏次之,在肝脏中表达量最低。组织贴壁法均可成功分离胎牛、3岁龄水牛、10岁龄水牛皮肤成纤维细胞。对3种不同年龄水牛的成纤维细胞第3代进行相关生物学特性分析。结果表明随着水牛年龄增大,S期细胞与细胞增殖指数显著降低(P<0.05),β-Gal阳性细胞增多(P<0.05),衰老基因p16、p21、p53mRNA表达水平均显著升高(P<0.05),SIRT6表达量显著降低(P<0.05)。免疫荧光结果表明,10岁龄水牛成纤维细胞DNA损伤位点增多,端粒损伤程度增加。上述结果表明,老龄水牛分离出的成纤维细胞较水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblast,BFF)细胞增殖速度变慢,衰老表型更显著。SIRT6基因与细胞衰老程度成负相关。构建SIRT6干扰载体,敲低水牛胎儿成纤维细胞SIRT6基因表达,进一步探讨SIRT6在水牛成纤维细胞衰老中的作用。构建干扰SIRT6基因的shRNA慢病毒载体,病毒包装后感染BFF P4筛选干扰载体。定量结果表明,Psi-sh3-LVRU6GP干扰效率最高(P<0.01)。以感染Psi-sh3-LVRU6GP病毒液的BFF P5为实验组(Ps-BFF P5),感染Psi-LVRU6GP空白质粒病毒液的BFF P5(PN-BFF P5)为对照组进行SIRT6基因功能的探讨。结果表明干扰SIRT6基因表达后,细胞变得粗大,扁平,折光性弱,细胞边缘变得不光滑。增殖速度变慢,传代后细胞汇合度难以长至100%,且培养过程中伴随着大量细胞死亡,生长曲线不再呈正常细胞增殖曲线的S型。周期试验结果表明Ps-BFF P5 S期、G2期细胞以及细胞增殖指数均显著低于PN-BFF P5(P<0.05),衰老基因0p16、p21、p53mRNA表达水平显著升高(P<0.05),β-Gal细胞阳性率显著增加(P<0.01)。Ps-BFF P5核型正常率为47%,PN-BFF P5核型正常率为83%,这表明SIRT6下调后核型正常率显著降低(P<0.05)。同时对SIRT6干扰阳性细胞端粒长度以及端粒保护蛋白复合物基因各组分进行了qRT-PCR分析。结果发现,干扰SIRT6后细胞端粒损伤位点及DNA损伤位点增加,损伤面积增大,但端粒长度与对照组相比无显著差异(P>0.05)。端粒保护蛋白复合物基因相对定量结果表明,TRF1、POT1、RAP1、TPP1、TIN2随着细胞SIRT6表达量下降而下降,但TRF2表达量却随着SIRT6表达下降而上升。以上结果表明,SIRT6是调控水牛成纤维细胞衰老的关键基因,干扰SIRT6表达会造成不可逆的DNA损伤以及端粒损伤。结果表明,水牛SIRT6是一个编码区长1080bp,编码359个氨基酸的基因。随着个体年龄越大,分离出的成纤维细胞体外培养寿命更短,呈现出更明显的衰老表型,SIRT6表达量更低。SIRT6是调控水牛成纤维细胞衰老的关键基因,干扰SIRT6表达会造成不可逆的DNA损伤以及端粒损伤。但SIRT6不能调控水牛成纤维细胞端粒长度,推测可能是通过调控DNA损伤及端粒损伤维护细胞基因组稳定,从而调控细胞衰老。