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研究目的
1.探讨Th17细胞(外周血、蜕膜)在因为不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)发病机制中的作用。
2.探讨URSA患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory t cells.Treg)对辅助性T淋巴细胞17(Thelper cell17,Th17)的调控功能是否存在障碍。
3.探讨URSA患者蜕膜组织Treg细胞对巨噬细胞(macrophage,Mψ)的调控功能是否存在障碍。
研究方法
1.选择15例URSA患者为实验组,15例正常早孕人工流产终止妊娠的妇女为对照组。流式细胞术(FCM)检测研究对象外周血和蜕膜中Th17细胞、Treg细胞表达水平；ELISA,Western blotting法分别检测外周血、蜕膜中IL-17、IL-23蛋白表达水平；实时半定量RT-PCR法检测蜕膜组织IL-17、IL-23及RORC mRNA表达水平。
2.采集17例URSA患者,20例对照组妇女外周血。FCM检测外周血中Th17细胞的表达水平及表达特点。采用共培养和Transwell体系培养方法,观察Treg细胞对Th17细胞的作用,ELISA方法测定培养液上清中IL-17的表达,FCM检测胞内IL-17及胞外CCR6的表达。磁珠分选(MACS)URSA患者外周血CD4+T细胞,观察不同浓度TGF-β、IL-10(0、0.1,1,5,10pg/ml),对IL-17表达的影响。
3.采集15例URSA患者和15例对照组蜕膜组织,比较两组MψCD80,CD86,IL-10与IFN-γ表达是否有差异。将URSA组Mψ分别与对照组、URSA组Treg细胞共同培养(直接、培养液中加入抗TGF-β抗体、Transwell体系)6天,FCM或ELISA方法检测MψCD80,CD86,IL-10,IFN-γ表达,了解2组Treg细胞对Mψ功能调控情况。
研究结果
1.与对照组相比,URSA组:(1)外周血、蜕膜Th17(CD4+IL-17A+)细胞表达水平明显增高,而Treg(CD4+CD25+CD127dim/-)细胞表达水平明显降低；Th17细胞与Treg细胞呈负相关；(2)血清Th17相关因子(IL-17、IL-23蛋白)表达水平明显增加；(3)蜕膜Th17相关因子(IL-17、IL-23、RORC mRNA及蛋白)表达水平明显增加。
2.与对照组相比,(1)URSA组外周血CD4+T细胞、Th17细胞趋化因子受体-CCR6+表达明显增加；(2)MACS分选外周血CD4+T细胞、Treg(CD4+CD25+)细胞及CD4+CD25-T细胞,体外培养6天,URSA组CD4+T细胞分泌IL-17明显增加；Treg细胞不分泌IL-17；而两组CD4+CD25-T细胞分泌IL-17的量,差异无统计意义；(3)Treg细胞与CD4+CD25-T细胞在Transwell体系中共培养6天后,两组IL-17表达差异无统计学意义；(4)TGF-β浓度为10ng/ml时,能抑制IL-17表达；(5)IL-10浓度为1ng/ml时能抑制IL-17的表达,其抑制力呈剂量依赖性；(6)体外培养实验中,Th17-CCR6的表达在两组间差异无统计学意义。
3.与对照组相比,(1)URSA组蜕膜Mψ单独培养后,MψCD80、CD86表达明显增高,MψIL-10表达明显降低；两组间MψIFN-γ的表达差异无显著意义；(2)两组Treg细胞均能下调URSA组MψCD80,CD86,IFN-γ的表达,但URSA组Treg细胞抑制力明显低于对照组；培养液中加入抗TGF-β抗体,或Transwell体系共培养后,Treg细胞不能抑制MψCD80,CD86,IFN-γ表达；(3)两组Treg细胞均能增加URSA组MψIL-10表达,但URSA组Treg细胞的刺激力明显低于对照组。Mψ培养液中加入anti-TGF-β或用Transwell体系共培养后,Treg细胞促进IL-10表达的能力明显降低。
研究结论
1.URSA患者Th17细胞及相关因子表达水平较正常早孕妇女明显增加,Th17细胞与Treg细胞呈负相关。我们认为这种促炎细胞可能与URSA的发生有关,母胎界面Th17/Treg平衡偏向Th17可能影响妊娠结局。
2.URSA患者外周血CD4+T细胞、Th17细胞趋化因子-CCR6+表达明显增加。Treg细胞能抑制Th17细胞IL-17的表达,但URSA患者Treg细胞抑制力降低；Treg细胞对Th17细胞CCR6的表达无明显调控作用。Treg细胞对Th17细胞的抑制力依赖细胞.细胞直接接触机制。TGF-β、IL-10能抑制产生IL-17的产生。
3.URSA患者蜕膜MψCD80,CD86及IL-10表达异常；Treg细胞能调控Mψ的功能,包括下调CD80,CD86及IFN-γ表达,增加IL-10表达；URSA患者蜕膜中Treg细胞对Mψ调控能力降低。
本研究首次在复发性流产领域中对Th17细胞特点及功能进行研究,并探讨了正常早孕及URSA妇女外周血、蜕膜中调节性t细胞、Th17细胞、巨噬细胞的相互调控,丰富了母胎免疫耐受理论,加深了对妊娠生理过程的认识,为研究URSA母胎免疫排斥提供新线索,为制定疾病的防治策略提供实验依据。当然、妊娠是精细调控且极为复杂的生命现象,正常妊娠的建立与维持必然依赖多重调控机制,有待于我们继续研究探索。