背景:到目前为止,艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)仍是在全世界范围内一种难以治愈的传染病,危害人们的健康。艾滋病由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)攻陷人体的CD4~+T免疫细胞所引发。在过去20年,随着抗逆转录病毒疗法(antiretroviral therapy,ART)的出现,艾滋病从一种致死性疾病转变成一种可控的慢性病。经过ART治疗的HIV感染者体内的CD4~+T细胞数会恢复到正常,并且血液内的病毒含量降到临床的检测线以下,基本可以拥有和正常人一样的寿命。但是由于HIV储存库的存在,ART并不能彻底清除HIV感染者体内的病毒基因,需要感染者终生服药。HIV储存库主要由静息CD4~+T细胞构成,当然也有少量的其他细胞,例如幼稚CD4~+T、巨噬细胞等。在这些细胞中,HIV将自身的核酸通过反转录整合入细胞的基因组中,但不进行病毒复制,只是潜伏存在于细胞的基因组中。这些被HIV潜伏感染的静息CD4~+T细胞,可以在人体中长期稳定存在,不能被ART药物或自身免疫系统清除。如果HIV感染者停止ART治疗,潜伏感染的HIV会在某些刺激下进行复制,导致血浆病毒反弹。所以,目前治愈HIV感染的最大障碍就是存在难以清除的HIV储存库。为了彻底清除HIV储存库,“shock and kill”治疗策略被提出。该策略的治疗理念是先激活潜伏的HIV,再通过ART或免疫细胞清除产生的病毒或宿主细胞,从而达到彻底清除病毒的目的。激活潜伏的HIV需要潜伏期逆转剂(latency-reversing agent,LRA)来完成。LRA种类很多,大部分处于临床前的研究阶段,目前还没有哪一个LRA能够在体内彻底逆转HIV的潜伏状态。在静息CD4~+T细胞中的HIV基因沉默与HIV启动子长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)区域的组蛋白去乙酰化密切相关。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)向HIV启动子区域的核小体募集,导致HIV基因的转录抑制。这种转录抑制可由组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACI)来逆转。HDACI属于LRA中的一大类,通过抑制HDAC的活性来促使LTR区域的核小体中的组蛋白乙酰化,使DNA与核小体结合松弛,利于转录因子的介入,从而引发潜伏HIV的转录激活。基于上面的机制,一系列HDACI作为“shock and kill”疗法的激活剂被广泛研究。其中一些抑制剂,如伏立诺他(vorinostat,SAHA)和帕比司他(panobinostat)等在体外和体内显示出了一定的潜伏重激活能力,并已经完成了临床实验,但是它们对HIV储存库的激活效能还远远无法达到彻底治愈HIV的程度。目的:为了解决HDACI激活效率不高的问题,本文提出了两种解决方案。一是寻找新型高效的HDACI来满足“shock and kill”治疗策略的需要;二是通过纳米技术来提高目前已有HDACI的潜伏HIV激活效率。在这项研究中,我们分两部分内容对上述两种解决方案分别进行了相关研究。方法与结果:一、发现新型组蛋白去乙酰酶抑制剂西达本胺具有激活潜伏HIV的潜能本章内容对新型HDACI西达本胺(chidamide)的潜伏HIV激活能力做了初步评价。西达本胺是我国首个自主研发的本酰胺类HDACI,被国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration,CFDA)批准用于治疗外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma,PTCL)。在本章研究中,我们通过以下实验在细胞水平证实了西达本胺对潜伏HIV的重激活作用。(1)我们利用组蛋白去乙酰化酶活性检测试剂盒,确定了西达本胺对HDAC的抑制作用,为后续实验奠定了基础。(2)我们通过MTS法检测了西达本胺的细胞毒性,实验结果发现西达本胺具有较小的细胞毒性。(3)接下来我们利用三种不同的HIV潜伏感染细胞模型,在三个层次对西达本胺的潜伏HIV重激活能力进行了验证。首先我们利用假病毒细胞系J-Lat Tat-GFP clone A7、J-Lat Tat-GFP clone A72和TZM-bl,检测其中的报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和荧光素酶来验证西达本胺激活HIV启动子的能力。然后利用含有HIV完整基因组的潜伏感染细胞系U1/HIV,通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测其分泌到细胞上清中的p24来证明西达本胺激活潜伏HIV的作用。最后我们招募了9名经过ART治疗的HIV感染者,其血液病毒含量已低于临床检测水平。我们从他们的血液样本中分选出了静息CD4~+T细胞,再给予西达本胺治疗,检测细胞上清中的病毒载量。实验结果发现西达本胺能够促使其中7名HIV感染者的样本重新出现HIV,说明西达本胺不仅可以激活细胞系中的潜伏HIV,也能够激活原代静息CD4~+T细胞中的潜伏病毒基因。(4)通过染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验对西达本胺的作用机制进行探讨。实验结果证明了西达本胺是通过提高HIV启动子区域的组蛋白乙酰化水平来激活潜伏HIV的转录。通过本章的研究,我们完成了西达本胺在细胞水平对潜伏HIV重激活的评价,证实了西达本胺具有激活HIV储存库的潜能,为后续的临床研究奠定了细胞学的实验基础。二、利用纳米技术提高组蛋白去乙酰化酶抑制剂对潜伏HIV的激活能力帕比司他是HIV储存库重激活领域研究最为前沿的HDACI之一,已经完成了相关的临床试验。但仍然存在很多不足,比如激活效率无法满足治疗要求、溶解度差、毒副作用高等缺点。因此急需一种方法来解决这些问题,提高激活效率、降低毒性。一个有希望的方法是利用纳米技术为现有药物开发出能够增强其激活效果的药物运输载体。在癌症治疗中,纳米载体运送体系相比于许多传统的药物运送方法,其优势已得到了充分的证实。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)和其他一些国家已经批准了几种纳米药物用于肿瘤治疗。在本章研究中,我们将纳米运送技术应用到HIV储存库重激活领域。为此我们合成了一种具有细胞穿膜功效的两亲性多肽(胆固醇-KG2R9多肽),该多肽能在水溶液中自组装形成稳定的纳米颗粒,并能够包裹小分子疏水药物,如帕比司他。包裹帕比司他的纳米粒子(PNP-P)通过内吞作用进入细胞,释放出帕比司他,这将增强HIV潜伏感染细胞对药物的摄取。释放的帕比司他将进入细胞核并作用于HDAC以促进潜伏HIV基因的转录。新产生的艾滋病毒可以被ART杀死,以实现彻底消除艾滋病毒的目标。为了验证上述假说我们进行了以下实验。(1)我们先对设计的纳米材料进行表征,利用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察纳米粒子的形貌,利用动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测量纳米粒子的粒径与电位,利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测纳米材料的包封率、载药率和体外的释药情况,利用DiO染色判断纳米粒子的稳定性。通过以上测试,我们成功构建了带有正电荷、稳定性好、具有缓释作用、直径约为80 nm的球状纳米载体药物PNP-P。(2)我们通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测了细胞对PNP-P的摄取能力。结果发现构建的纳米药物比单独的帕比司他更容易被HIV潜伏感染的细胞摄取。提高了细胞对药物的摄取能力,有利于增加药物的激活效率。(3)在评价了PNP-P的细胞摄取能力后,我们又通过流式细胞术检测了纳米药物的细胞毒性。PNP-P处理后的细胞仍有90%左右的存活率,说明我们的纳米药物细胞毒性较小。(4)促使组蛋白乙酰化是激活潜伏HIV的关键。我们通过流式细胞术检测了经过PNP-P处理后细胞组蛋白乙酰化水平的变化。实验结果证明PNP-P能够增加细胞的组蛋白乙酰化水平,为其发挥激活作用提供了理论基础。(5)在体外,通过三个层次的HIV潜伏感染细胞模型验证PNP-P对病毒储存库的激活能力。首先,利用假病毒细胞模型J-Lat Tat-GFP clone A72和J-Lat Tat-GFP clone A82,通过流式细胞术检测报告基因GFP的表达情况,证明了PNP-P能够激活假病毒细胞模型中HIV的启动子。然后,利用潜伏感染细胞模型ACH2和U1/HIV,通过检测激活标志物CD69、HIV衣壳蛋白p24以及细胞上清中的病毒载量,我们发现,PNP-P具有优于单独使用帕比司他的潜伏HIV激活效果。最后,为了验证PNP-P的体外激活能力,我们招募了两名经过ART治疗的HIV感染者,其血液病毒含量已低于临床检测水平。从两名HIV感染者的血液样本中分离出外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),给予纳米药物干预,实验结果发现PNP-P能够增加样本细胞上清中的病毒载量。这些结果证实了我们构建的纳米递送体系能够在体外细胞水平帮助药物提高潜伏HIV的激活能力。(6)为了检测PNP-P对体内潜伏HIV的激活能力,我们开展了相关的动物实验。将J-Lat Tat-GFP clone A72细胞注射到联合重度免疫缺陷小鼠(M-NSG)体内,再给予一定剂量的纳米药物干预。24小时后,从小鼠体内分离出J-Lat Tat-GFP clone A72细胞,流式细胞术检测GFP发光情况。实验结果证明了PNP-P能够在体内激活J-Lat Tat-GFP clone A72细胞并且其激活效率远高于单独帕比司他给药组。同时我们还对纳米药物的生物安全性进行了评价。我们收集了小鼠的血清以及各个脏器进行了生化指标检测和组织切片H&E染色拍照。分析生化指标检测的结果发现,PNP-P处理没有对心脏、肝脏和肾脏的功能产生影响;H&E染色结果也没有发现心脏、肝脏、脾脏、肺部以及肾脏出现任何异常,说明了我们构建的纳米体系没有毒副作用,具有良好的生物相容性。通过本章的研究,我们证明了PNP-P具有优于单独使用帕比司他的潜伏HIV重激活作用。该研究表明纳米技术可以帮助现有LRA改善潜伏HIV的激活效率,这项研究为进一步开发用于HIV储存库重激活的LRA输送系统奠定了基础。结论:综上所述,本文为解决HDACI等LRA激活效率低的问题提供了两种解决方案,即新的有效药物和新的给药策略。本研究证实了西达本胺作为一种新的LRA对潜伏HIV的激活能力,同时明确了利用纳米技术提高了现有LRA(帕比司他)激活HIV储存库的应用前景。这些均为实现HIV储存库的彻底清除奠定了重要的理论依据和实验基础。