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目的:肺炎克雷伯菌是医院内感染和社区获得性感染的重要条件致病菌,是多重耐药菌与泛耐药菌的代表菌。KbvR为肺炎克雷伯菌一类含HTH结构域的转录调控因子,可能与细菌致病性相关。构建肺炎克雷伯菌KbvR基因缺失突变株△KbvR与回补株C-KbvR,分析KbvR在细菌生长、致病力、生物膜形成、荚膜合成及I与III型菌毛形成中的作用,阐述KbvR在肺炎克雷伯菌致病过程中的作用机制。方法:采用基于同源重组原理的基因敲除技术,利用温度敏感性自杀载体pKO3质粒构建KbvR调控子的无痕突变株,同时将包含KbvR基因编码区、上游启动子结合区约900 bp及下游转录终止区约600 bp的基因片段克隆至pGEM-T-easy质粒后电转至突变株获得回补株。LB培养基37°C培养三种菌株,连续不同时间点取菌液检测OD600值,绘制细菌生长曲线观察KbvR基因对细菌生长速度的影响。小鼠毒力实验分析不同菌株LD50及小鼠肝、肺组织病理变化,观察KbvR基因对肺炎克雷伯菌毒力的影响。RNA-seq技术分析突变株与野生株表达谱变化,寻找可能受KbvR调控的靶基因。结合RNA-seq结果及关于肺炎克雷伯菌致病性研究结果,从可能受到KbvR调控的基因中挑选部分基因进行深入研究。利用结晶紫定量试验比较不同菌株生物膜形成能力,分析KbvR调控子对细菌生物膜形成的调控作用;细菌拉丝实验、离心实验比较不同菌株荚膜形成能力,分析KbvR基因对细菌荚膜形成的调控作用;酵母凝集实验分析KbvR基因对肺炎克雷伯菌I型菌毛形成的影响,甘露糖抗性血凝实验检测KbvR基因对细菌III型菌毛合成的影响,分析KbvR基因对细菌菌毛形成的影响。提取肺炎克雷伯菌野生株和突变株RNA,利用RT-PCR检测分析KbvR基因对肺炎克雷伯菌荚膜合成相关结构基因和菌毛形成相关结构基因及局部调控基因的调控作用,分析KbvR调控子调控细菌致病性的具体机制。结果:成功构建KbvR基因无痕突变株△KbvR及回补株C-KbvR,RT-PCR发现KbvR基因在△KbvR菌株中无表达,在WT与C-KbvR中表达。细菌生长曲线发现三种菌株生长速度无明显差别,说明△KbvR基因并不影响细菌生长速度。小鼠毒力实验发现KbvR基因敲除后肺炎克雷伯菌毒力明显下降,感染敲除株活菌的小鼠存活率明显高于感染WT的小鼠并且肝、肺组织无明显病理变化。RNA-seq发现KbvR调控304个基因转录,其中上调65个,下调239个。这些受调控的基因包括其它转录调控因子、荚膜与I型菌毛合成相关基因、铁摄取相关基因、尿素酶基因、糖转运PTS系统及功能未知蛋白。挑取部分基因进行深入研究,表型实验发现KbvR基因敲除后细菌生物膜形成能力明显下降,结晶紫定量实验发现△KbvR生物膜形成量显著低于WT(P<0.01);拉丝实验和超高速离心实验结果显示△KbvR荚膜形成能力明显下降;酵母凝集实验和甘露糖抗性血凝实验发现△KbvR I与III型菌毛合成量明显升高。定量RT-PCR结果显示KbvR基因敲除后荚膜结构基因magA表达量降低,而局部调控基因rmpA和rcsA表达量升高;I型菌毛结构基因fimA和调控基因fimK,III型菌毛结构基因mrkA和调控基因mrkH表达量均升高。结论:(1)KbvR基因正调控细菌致病性,KbvR基因敲除株细菌毒力明显下降。而KbvR基因不影响细菌生长能力,说明KbvR对细菌致病性的影响并不是通过影响细菌生长而产生,KbvR调控子调控部分细菌致病相关因素。(2)KbvR调控子正调控肺炎克雷伯菌重要致病相关因子--生物膜的形成。(3)KbvR调控子正调控荚膜形成而负调控I与III型菌毛合成。(4)KbvR调控子通过调控荚膜、菌毛合成及生物膜的形成而影响细菌毒力。