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红景天(Rhodiola.L)是我国一种传统的药用植物,生长于高山地带,素有“高原人参”之美誉。其中,红景天苷和酪醇在红景天中行使主要的药用功能。目前,由于红景天属植物的基因序列缺乏,国内外的研究主要集中在代谢组学方面,而对基因组学的研究少之又少。就目前研究现状而言,无法解决红景天属的植物所面临的一系列问题。为了进一步的推进红景天属植物的研究进展,本课题组主要从内生真菌和大花红景天的基因组学及代谢组学方面入手对内生真菌处理不同时期的红景天中次生代谢产物红景天苷合成的关键酶基因的表达规律以及红景天苷含量的变化进行研究。首先,以活性内生真菌ZPRs-R-11、ZPRa-R-1与红景天组培苗簇互作为基础,通过实时荧光定量PCR,以geNorm、NormFinder、BestKeeper等三个软件分析管家基因的稳定性,最后筛选不同处理条件下红景天组培苗中稳定表达的管家基因。其次,以活性内生真菌ZPRs-R-11与红景天组培苗簇互作为基础,运用RP-HPLC和2-△△CT的方法分析活性内生真菌ZPRs-R-11对红景天苷的含量以及红景天苷合成途径中关键酶基因的表达量的影响。最后,以活性内生真菌ZPRa-R-1与红景天组培苗簇互作为基础,通过实时荧光定量PCR,以同样的方法分析内生真菌ZPRa-R-1对红景天苷的含量以及合成起途径中关键酶基因的表达量的影响。 结果表明,(1)经内生真菌ZPRs-R-11、ZPRa-R-1与大花红景天组培苗簇互作条件下,通过对所选的8个管家基因的稳定性分析发现,最精确的校准误差方法为双内参基因组合。在相应的处理情况下,用于研究ZPRs-R-11和ZPRa-R-1影响宿主关键酶基因表达规律的双内参纪基因分别是PCS和UBQ,GAPDH和PCS。(2)真菌ZPRs-R-11对红景天苷的含量和关键酶基因的表达产生规律性的影响,PAL、TyDC、TAT、UDPGT四个限速酶基因的相对表达量和红景天苷的含量都在第10d的时候达到了最大值,其值分别为对照的2.9倍、5.7倍、1.2倍、11倍,处理组红景天苷含量为1.79mg·g-1,为对照组的6倍,并且四个限速酶基因与红景天苷含量呈正相关性;对于代谢途径中的中间酶而言,它们的基因表达活性都表现出一定的规律趋势,并与红景天苷的含量都分别呈正相关。因此得出,内生真菌ZPRs-R-11可以通过调节苯丙氨酸解氨酶代谢途径和酪氨酸代谢途径来促进红景天苷的积累,但对是酪氨酸脱羧酶代谢途径的作用效果比酪氨酸转氨酶的效果显著。(3)真菌ZPRa-R-1对红景天苷合成代谢关键酶基因和红景天苷的含量也产生规律性影响,但是与内生真菌ZPRs-R-11的影响略有所不同,PAL、TyDC、UDPGT三个限速酶基因的表达量与红景天苷的含量呈高度正相关性,而ZPRa-R-1对限速酶TAT却没有产生规律性的影响,并且其与红景天苷的含量高度不相关,关于代谢途径中的中间酶C4H和PCD而言内生真菌ZPRa-R-1没有对其产生影响,而另外两个中间酶MAOA和ADH却受到了显著的规律性影响并与红景天苷的含量呈高度正相关。因此,ZPRa-R-1能促进酪氨酸代谢途径中的酪氨酸脱羧酶途径进行红景天苷的积累,但是不能促进酪氨酸途径中的酪氨酸转氨酶途径和苯丙氨酸解氨酶途径进行红景天苷的积累。 通过本课题的研究,揭示了内生真菌与宿主大花红景天的代谢之间存在因果关系。真菌与大花红景天的互作,可以引起不同代谢途径中关键酶基因表达的变化,最终导致宿主植物次级代谢产物的积累和变化。这为挖掘内生真菌资源、寻找促进红景天药用成分积累的有效方法提供研究依据。