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煤焦沥青(Coal tar pitch, CTP)是以多环芳烃类物质为其主要成分,已经被确认为人类致癌物,其致癌机制还不清楚,需要进一步研究。染色不稳定性(Chromosomal Instability, CIN)学说越来越引起人们的密切关注。研究发现,染色体不稳定性是肿瘤细胞的一个普遍特征,与肿瘤的发生机制有关。除了染色体不稳定性外,绝大多数实体肿瘤还存在中心体异常的现象。中心体异常是染色体不稳定形成的主要原因,具体机制需要进一步的研究。许多抑癌基因及其产物和激酶,如P53、BRCA1/2、CDK2/CyclinE复合物等都参与了中心体复制的调控。P53失活或表达降低和CyclinE过度表达,可导致中心体扩增进而导致染色体不稳定,对肿瘤的发生产生深远的影响。目的该课题以人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞系作为研究对象,用煤焦沥青烟提取物诱导其发生恶性转化,探讨BEAS-2B细胞恶性转化过程中染色体核型和中心体的改变情况,以及恶性转化过程中中心体异常的可能分子生物学机制,为探索煤焦沥青致肺癌的发病机制提供科学的理论依据。方法1.用气相色谱-质谱联用技术分析煤焦沥青烟提取物溶液的成分。实验分3组：即煤焦沥青组(煤焦沥青烟提取物溶液)、DMSO组、正常对照组(生理盐水)。2.以煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,MTT法测定BEAS-2B细胞的LC50。以近20% LC50对细胞进行诱导,观察细胞增殖和细胞形态的变化。3.油镜下观察第10、20和30代细胞染色体,计数染色体数目。采用间接免疫荧光法检测中心体的变化。4.提取第10、20和30代细胞的总RNA,用实时定量PCR检测P53、P21和CyclinE mRNA表达水平。免疫组化方法检测P53、P21和CyclinE蛋白表达水平。5.采用统计软件SPSS12.0进行数据分析。测得的数据用均数±标准差(x±s)表示。检验水准a=0.05。结果1.煤焦沥青烟提取物溶液经气相色谱-质谱联用技术分析,鉴定出主要成分是多环芳烃类化合物(87.91%)。计算出半数致死浓度LC50为8.64 mg/L,确定最终的染毒剂量为2 mg/L。2.诱导后,细胞从第10代到第30代,二倍体核型比例呈下降趋势,出现了大量非整倍体,表明细胞在生长繁殖过程中存在染色体不稳定。3.诱导后,第10代细胞中心体总异常率在3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；到第20代时,中心体总异常率升高,主要表现为数目异常(3.41%)；到第30代时,中心体总异常率进一步升高,表现为中心体数目增多,体积增大和数目及体积同时异常。4.诱导后细胞中心体异常和染色体不稳定性呈正相关(r=0.75,P=0.02),表明中心体异常与染色体不稳定性间有密切关系。5.诱导后,第10代细胞P53、P21和CyclinE mRNA和蛋白质的表达3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；诱导后第20代、30代细胞P53和P21 mRNA和蛋白质的表达量均降低,而CyclinE mRNA和蛋白质的表达量均升高,差异有统计学意义(P<0.05)；蛋白P53和P21间存在正相关,而CyclinE与P53和P21分别呈负相关。从第10代到第30代,蛋白P53和P21表达逐步下降,而蛋白CyclinE表达升高。6.诱导后第20和30代细胞中心体异常率和蛋白质P53、P21和CyclinE相关性分析发现,中心体总异常率与P53和P21蛋白间均呈负相关性(r=-0.57,P=0.01；r=-0.65,P=0.00),而中心体总异常率与CyclinE呈正相关性(r=0.57,P=0.01)。结论在煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶性转化过程中,细胞可通过P53/P21通路调控中心体复制过程。中心体异常在细胞染色体不稳定性发生中可起重要作用。