前言肿瘤细胞对化疗药物获得耐药性是恶性肿瘤病人临床治疗过程中的一个主要问题,这一现象被称为多药耐药(multidrug resistance, MDR)。肿瘤细胞耐药性的机制多种多样,对MDR研究最多的方面是ATP结合盒转运蛋白超家族(ATP binding cassette, ABC),后者在细胞膜表达的增高有助于药物迅速被转运至细胞外,导致药物在细胞内的积聚减少。因此ATP结合盒转运蛋白超家族被认为是导致MDR产生的一个重要分子。多药耐药相关蛋白家族(Multidrug-resistance-associated proteints, MRPs)属于ABC转运蛋白超家族的C亚家族(subfamily C of the ABC transporter superfamily, ABCC)。在人类,MRP家族有多个成员(MRP1-MRP9)。已有大量文献证实其中MRP1在MDR中发挥了非常重要的作用。虽然Mrp1在MDR中具有重要作用,但对其表达调控的机制却并不十分清楚。然而有大量研究表明,MRPs常与Ⅱ相解毒酶协同作用,二者表达的调控具有相似性。Ⅱ相解毒酶的诱导表达主要通过抗氧化反应元件(antioxidant response elements, ARE或EpRE),据此我们推测最可能参与MRPs表达调控的顺式作用元件也是ARE。功能性ARE序列含有一个共同的核心区5’-GTGACnnnGC-3’,n代表任意的核苷酸。而且最近发现在小鼠Mrp2, Mrp3, Mrp4基因的启动子区存在ARE序列,且序列也被实验证实,这更加提示了存在着抗氧化反应元件ARE很可能参与Mrp1基因的表达调控的可能性。Nrf2是一个重要的转录因子,它可以进入细胞核内与其下游多个基因启动子区域的ARE结合,诱导靶基因例如NQO1,GCS,HO-l的表达,参与抗氧化反应调控。Nrf2信号通路的激活增强了细胞防御系统,促进细胞在不利的环境下存活。然而近期研究报道发现Nrf2组成型表达增高可促进了癌症的发生和肿瘤耐药,这被称为Nrf2信号通路的阴暗面。研究证明Nrf2在多种癌细胞中可导致肿瘤耐药。但是Nrf2分子是如何发挥这样的作用仍然不是十分清楚。另外又是哪个(些)下游分子受到Nrf2信号通路的紧密调控后导致肿瘤耐药?MRP1是不是Nrf2信号通路下游的靶分子?为了证实我们对于抗氧化反应的重要信号通路Nrf2-ARE信号通路的激活参与了Mrp1基因的表达调控的推测,本课题从两株耐药性不同的人肺小细胞癌肿瘤细胞株以及人体肺癌、乳腺癌、胃癌,肠癌组织标本两方面对Nrf2与Mrpl表达的相互关性及对肿瘤耐药性的影响进行观察和研究,并采用荧光素酶报告基因实验,染色体免疫共沉淀等实验,明确转录因子Nrf2与Mrpl基因启动子区域的直接作用。本实验研究了Nrf2-ARE信号通路可能的阴暗面,即参与了多药耐药蛋白MRP1的表达调控。这将有助于我们在源头上寻找多药耐药过程的关键点,为肿瘤的化疗提供可能的靶点。第一部分Nrf2促进人耐药肺小细胞癌细胞H69AR的耐药目的：明确Nrf2对人耐药肺小细胞癌细胞H69AR的耐药影响。方法：选用两株耐药性不同的肺小细胞癌肿瘤细胞株：药物敏感型细胞株H69和耐药株H69AR,应用realtime PCR及Western方法比较Nrf2, MRPs及Ⅱ相解毒酶的表达差异；应用MTT检测两株细胞的药物敏感性差异；采用Nrf2siRNA双链寡核苷酸干扰耐药肺小细胞癌H69AR细胞；随后应用Western方法检测H69AR细胞干扰前后Nrf2, MRP1的表达差异；应用MTT检测耐药株H69AR细胞在Nrf2干扰前后药物敏感性的差异。结果：相对于H69细胞,H69AR细胞中Nrf2及Mrp1mRNA及蛋白均高表达,且耐药性随着Nrf2、Mrp1表达的增高而耐药性增强。Nrf2siRNA干扰后,可以下调肺小细胞癌耐药株H69AR细胞内Mrpl的蛋白表达,同时相对干扰前,H69AR细胞对化疗药物由耐药变为敏感。小结：Nrf2可以通过上调人耐药肺小细胞癌细胞H69AR细胞内的MRP1蛋白的表达,促进其耐药。第二部分Nrf2通过直接与Mrpl基因启动子区的ARE位点结合,促进Mrpl的表达目的：探索Nrf2-ARE通路如何调控Mrpl基因表达,明确Mrpl是否为Nrf2的下游靶基因。方法：在人Mrpl基因5’启动子区域,搜寻可能的ARE序列。化学合成野生型ARE序列以及针对ARE序列上的关键位点进行点突变；构建相应的ARE野生型荧光素酶报告基因质粒,及ARE突变型萤光素酶报告基因质粒,并转染至MDA-MB-231细胞内,观察Nrf2刺激后的荧光素酶活性的改变。设计针对Mrpl基因启动子区域ARE序列的引物,通过染色体免疫共沉淀法,明确转录因子Nrf2与Mrpl启动子区的ARE位点直接结合。结果：在人Mrpl基因5’启动子区域,发现两个可能的ARE位点,被命名为ARE1及ARE2。荧光素酶报告基因实验提示过表达Nrf2可增加ARE1及ARE2介导的启动子活性的诱导,而突变型ARE1及ARE2则降低了Nrf2诱导的启动子活性。231细胞染色体免疫共沉淀显示,在tBHQ刺激诱导核转录因子Nrf2高表达后,这些过表达的Nrf2转录因子随即被招募至Mrpl基因启动子区的ARE1及ARE2位点。同时,比较CHIP实验证实,与H69细胞相比,H69AR细胞中与AREl及ARE2结合的Nrf2更多。小结：Mrpl基因启动子区发现ARE1及ARE2位点。核转录因子Nrf2可以与Mrpl基因的ARE1及ARE2位点直接结合。Mrpl为Nrf2靶基因。第三部分人癌组织中Nrf2,NQO1及Mrpl的表达及其相互关系目的：阐明人小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌组织中Nrf2,NQO1及Mrp1的表达以及三者的相关性。方法：采用IHC的方法检测40例人癌组织标本(小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌组织各10例)中Nrf2、NQO1及Mrp1的表达；IHC染色切片应用i-Solution软件将三者在癌组织中的表达进行分析和定量；Pearson’s相关分析比较三者表达的两两相关性。结果：Nrf2蛋白主要为细胞胞核内表达,细胞浆内有部分表达。MRP1在胞浆和胞膜均有表达,而NQO1主要表达在细胞质中；染色数据和统计分析显示,三个指标在癌组织中的表达远远高于癌旁组织；MRP1的表达与Nrf2有很强的相关性,经Pearson’s相关分析,两者之间的相关系数在小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌及大肠癌组织中的相关系数依次为0.899,0.871,0.866,0.800,P<0.001。小结：Nrf2与NQO1及Mrpl的表达相关,且在癌组织中较癌旁组织明显高表达。