研究背景多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种浆细胞恶性增殖性疾病,主要表现为骨髓中浆细胞恶性克隆性增殖,血液和尿液中单克隆免疫球蛋白增加,以及相关的器官功能衰竭[1]。MM是第二大最常见的血液恶性肿瘤,约占血液恶性肿瘤的13%[1]。过去十年,随着自体干细胞移植技术和沙利度胺(Thalidomide)、来那度胺(Lenalidomide)、硼替佐米(Bortezomib)等抗癌药物应用于MM临床治疗,MM的治疗效果明显提高,60岁以下MM病人10年生存率达到30%。蛋白酶抑制剂Bortezomib主要作用于26S蛋白酶体的亚基β5,是一种被广泛应用的且效果较好的MM治疗药物,但是目前临床上已经出现了针对Bortezomib的耐药现象[2,3]。随着抗MM药物的广泛使用,MM细胞产生的耐药性和药物本身的细胞毒性已经成为MM治疗中的重要难题。为了应对这个难题,研究人员开发出了一些新的化学治疗药物,这些药物特异性地作用于细胞周期和蛋白降解途径中的重要调节因子,其中部分药物已经进入到临床试验阶段,如MLN4924。MLN4924是一种高活性,高选择性的神经前体细胞发育表达下调蛋白(Neural precursor cell Expressed,Developmentally Down-regulated 8,NEDD8)活化酶(NEDD8-Activating Enzyme,NAE)抑制剂。MLN4924主要通过抑制类泛素蛋白NEDD8活性而阻断其与Cullin-RING泛素E3连接酶(Cullin-RING Ligases,CRL)的接合,进而抑制一些细胞周期和细胞生长相关蛋白的泛素化降解,并最终抑制细胞增殖和生长。目前研究人员已经在实验动物水平证实MLN4924能通过抑制复合体Skpl/Cullin-1/F-box SKP2(SCFSkp2)亚基P27和P21的降解而发挥治疗MM的作用[4]。CDC28 激酶调节亚单位 1B(CDC28 protein Kinase regulatory Subunit 1B,CKS1B)是CRL/SCF复合体中一个重要的共作用因子。CKS1B协助SCFSkp2复合物调节处于细胞周期中的细胞从G1期顺利进展到S期,并通过P27依赖和非依赖性的通路发挥抑制细胞凋亡的作用,是引起MM治疗耐药的一个重要因子[5]。作为细胞分裂和增殖中的关键蛋白[6],CKS1B在多种肿瘤组织中高表达,包括肝细胞癌[7],结肠癌[8],肺癌[9],口腔鳞状细胞癌[10],乳腺癌[11]等。CKS1B基因位于与疾病预后差,临床进展迅速,治疗方案选择极少密切相关的1q21区域[12,13]。CKS1B的表达增加还与以下两种疾病的进展密切相关,即良性状态的意义未明的单克隆丙种球蛋白病(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance,MGUS)向MM的转化和MM进展转化为浆细胞白血病[14]。我们之前的研究已经证实CKS1B是与MM病人存活时间显著相关的70个高风险基因之一[15],此外,CKS1B高细胞核表达是复发性/难治性MM的不良预后指标[16]。总之,种种研究表明CKS1B是我们研究如何更好治疗MM的一个重要靶基因。本课题中,我们检测了 CKS1B过表达的MM细胞对MLN4924治疗的敏感性;证实了 MLN4924抑制CKS1B过表达的MM细胞增殖,生长和克隆形成的能力,并能促进CKS1B过表达的MM细胞发生衰老;最后,我们发现MLN4924是通过抑制P21泛素化降解途径而发挥杀灭CKS1B过表达MM细胞的作用,而与CKS1B调节SCFSkp2复合体和NEDD8依赖性的SCFSkp2激活无关。研究目的1.探究过表达CKS1B的MM细胞对Bortezomib耐药,而对MLN4924敏感;2.研究CKS1B对neddylation相关信号通路的调节;3.证实MLN4924通过抑制P21泛素化降解而克服CKS1B引起的MM细胞耐药;4.进一步证实P21在MLN4924对CKS1B过表达MM细胞发挥敏感作用的重要性;5.结合临床证实neddylation通路调节异常和MM的耐药及不良预后密切相关。研究内容和方法1.探究过表达CKS1B的MM细胞对Bortezomib耐药,而对MLN4924敏感1)通过分子克隆技术,构建插入CKS1B基因片段的pCMV/AIG-CKS1B-GFP的质粒,利用磷酸钙法包装慢病毒,转染并构建稳定过表达CKS1B的MM细胞 OCI-My5 和 ARP1;2)通过流式细胞术,检测慢病毒的转染效率,并通过western blot验证CKS1B在OCI-My5和ARP1中的稳定过表达;3)通过细胞生长曲线探究药物MLN4924或Bortezomib对CKS1B过表达的MM细胞OCI-MY5和ARP1的作用;4)通过细胞克隆形成实验探究不同药物浓度MLN4924或Bortezomib对CKS1B过表达的细胞OCI-My5和ARP1平板克隆形成能力的影响;5)应用细胞衰老实验探究诱导低表达CKS1B和药物MLN4924或Bortezomib对CKS1B稳定过表达MM细胞OCI-My5和ARP1发生细胞衰老的影响。2.研究CKS1B对neddylation相关信号通路的调节1)通过western blot验证NEDD8(Cullin-1)在诱导低表达和稳定过表达CKS1B的MM细胞OCI-My5和ARP1的表达;2)MLN4924处理稳定过表达CKS1B的MM细胞OCI-My5和ARP1,通过western blot检测药物处理后的细胞中NEDD8(Cullin-1)的表达。3.证实MLN4924通过抑制P21泛素化降解而克服CKS1B引起的MM细胞耐药1)选择不同的药物浓度的MLN4924或Bortezomib处理CKS1B过表达的OCI-My5 和 ARP1 48 h;2)通过western nlot探究药物处理过的CKS1B过表达细胞OCI-My5,ARP1中的P21,P27,P-RB,Cullin1-NEDD8等蛋白的表达情况;3)通过RT-PCR探究经药物处理过的CKS1B过表达的细胞OCI-My5,ARP1中的P21 mRNA的表达。4.进一步证实P21在MLN4924对CKS1B过表达MM细胞发挥敏感作用中的重要性1)应用CRISPR/CAS9基因敲除技术,构建插入P21sgRNA基因片段的pLentiCRISPR-P21sgRNA 质粒;2)通过磷酸钙技术包装慢病毒,转染并构建P21敲除的CKS1B过表达的MM细胞 OCI-My5;3)用不同药物浓度MLN4924处理敲除P21的CKS1B过表达MM细胞OCI-My5达24 h,通过Western Blot检测P21在药物处理过细胞中的表达;4)用不同药物浓度的MLN4924处理敲除P21的CKS1B过表达的MM细胞OCI-My5,通过细胞生长曲线、细胞克隆形成实验、细胞衰老实验验证敲除P21是否影响MLN4924对CKS1B过表达MM细胞的作用。5.结合临床证实neddylation通路调节异常和MM的耐药以及不良预后密切相关1)检测neddylation通路基因在健康正常人、MGUS、MM中的表达;2)MM病人接受dexamethasone和Bortezomib联合治疗后分成有疗效和无疗效组,分别检测两组中NEDD8的表达;3)MM病人分别接受dexamethasone或者Bortezomib的治疗,分别分成有效组和无效组,检测各组内NEDD8的表达;4)Kaplan-Meier和long-rank检测比较不同neddylation通路基因表达的MM病人的总生存期;5)Kaplan-Meier和long-rank检测比较表达不同的CKS1B和neddylation通路基因各组合内的MM病人的总生存期。研究结果1.过表达CKS1B的MM细胞对Bortezomib耐药,而对MLN4924敏感1)通过分子克隆技术,构建插入CKS1B基因片段的pCMV/AIG-CKS1B-GFP质粒,通过IRES Reverse引物对构建质粒进行基因测序,测序结果表明质粒构建正确。借HEK-293T工具细胞,磷酸钙法包装病毒,转染并构建稳定过表达 CKS1B 的 MM 细胞 OCI-My5 和 ARP1;2)通过流式细胞术,检测慢病毒的转染效率,结果表明,OCI-My5和ARP1的病毒感染效率高达95%左右,Western Blot结果表明CKS1B在OCI-My5和ARP1中的稳定过表达;3)通过细胞生长曲线探究药物MLN4924或Bortezomib对CKS1B过表达的MM细胞 OCI-My5 和 ARP1 的作用。用 1uM MLN4924 或 5nM Bortezomib 处理CKS1B过表达细胞OCI-My5和ARP1七天,设置三个复孔,结果以means ± SD表示。结果表明,空白对照组细胞对Bortezomib和MLN4924均敏感,而CKS1B过表达的细胞对Bortezomib治疗耐药,而对MLN4924治疗敏感;4)通过细胞克隆形成实验探究不同药物浓度MLN4924或Bortezomib对CKS1B过表达的细胞OCI-My5和ARP1的细胞克隆形成能力的影响;结果表明药物处理空白对照组内的细胞克隆形成均显著减少,经Bortezomib处理后CKS1B过表达的细胞克隆数量无明显减少,而MLN4924处理组细胞克隆数量显著减少;5)利用细胞衰老实验探究诱导低表达CKS1B和MLN4924或Bortezomib对CKS1B稳定过表达的OCI-My5和ARP1细胞发生衰老影响。结果表明:CKS1B的诱导低表达能促进细胞发生衰老;MLN4924相比于Bortezomib能更显著地促进CKS1B过表达的MM细胞发生衰老。2.CKS1B调节neddylation相关信号通路的基因1)通过western blot验证NEDD8(Cullin-1)在诱导低表达和稳定过表达CKS1B的MM细胞OCI-My5和ARP1的表达。结果表明:NEDD8(Cullin-1)的表达变化与CKS1B在MM细胞中的表达变化趋势一致;2)MLN4924处理稳定过表达CKS1B的MM细胞OCI-My5和ARP1,通过western blot检测NEDD8(Cullin-1)在药物处理细胞中的表达。结果表明MLN4924能显著抑制CKS1B过表达MM细胞中NEDD8(Cullin-1)的表达。3.MLN4924通过抑制P21泛素化降解而克服CKS1B引起的MM耐药1)选择不同的药物浓度的MLN4924或Bortezomib处理CKS1B过表达的OCI-My5 和 ARP1 达 48 h;2)通过western blot探究药物处理的CKS1B过表达细胞OCI-My5和ARP1中的P21,P27,P-RB,CUL1-NEDD8等蛋白的表达。结果表明:Bortezomib和MLN4924处理细胞后均能引起P27表达增加,P-RB表达降低;而P21在MLN4924处理的CKS1B过表达MM细胞中的表达显著高于Bortezomib处理的细胞,且 MLN4924 完全阻断了 Cullin-1 的 neddylation;3)通过RT-PCR探究经药物处理过的CKS1B过表达的OCI-My5,ARP1中的P21在mRNA水平的表达。结果证实P21 mRNA在MLN4924处理组的表达较Bortezomib处理组显著增加。4.P21在MLN4924对CKS1B过表达MM细胞发挥敏感作用中的重要性1)应用CRISPR/CAS9的基因敲除技术构建插入P21sgRNA基因序列的pLentiCRISPR-P21sgRNA 质粒;用 U6 promotor forward primer 进行基因测序,结果显示质粒构建成功。2)通过磷酸钙技术包装病毒,转染并构建P21敲除的CKS1B过表达的MM细胞OCI-My5;合适浓度的puromycin进行细胞筛选,筛选出特异的具有puromycin抗性的P21敲除的CKS1B过表达的MM细胞。3)因P21在CKS1B过表达MM细胞中本底表达低,用不同药物浓度的MLN4924处理P21敲除的CKS1B过表达的MM细胞OCI-My5达24 h以诱导P21的表达,并通过western blot验证;结果表明MLN4924处理敲除P21的细胞后P21的表达无明显增加,证实P21在CKS1B过表达细胞OCI-My5中的敲除成功;4)不同药物浓度的MLN4924处理P21敲除的CKS1B过表达的细胞OCI-My5,通过细胞生长曲线、细胞克隆形成实验、细胞衰老实验验证P21在CKS1B过表达的OCI-My5中的敲除对MLN4924在CKS1B过表达MM细胞的细胞增殖和生长、细胞克隆形成能力以及细胞发生衰老等的影响。结果表明:MLN4924在CKS1B过表达MM细胞的细胞增殖、细胞克隆形成能力的抑制及促进细胞衰老的作用依赖于P21的表达,P21的表达降低明显降低了 CKS1B过表达MM对MLN4924的敏感性。5.结合临床病人标本证实neddylation通路基因调节异常与MM的耐药以及不良预后密切相关1)检测neddylation通路基因在NPC、MGUS、MM中的表达谱。结果表明:相比于健康正常人,NAE1、UBA3、UBC12和NEDD8的mRNA在MM中表达增加;2)MM病人接受dexamethasone和Bortezomib联合治疗后分成有疗效和无疗效组,检测两组中NEDD8的表达;结果表明无效组较有效组内病人的NEDD8的mRNA表达增加;3)MM病人分别接受dexamethasone或Bortezomib治疗,分别分成有效组和无效组,检测各组内NEDD8的表达;结果显示:Bortezomib无效组较dexamethasone无效组内的NEDD8 mRNA表达显著增加;4)Kaplan-Meier和log-rank检测比较不同neddylation通路基因表达的MM病人的总生存期。结果表明:高表达基因UBA3(p = 0.003)、UBC12(p = 0.001),或CKS1B(p = 0.015)较低表达MM的总生存期和预后显著降低;5)Kaplan-Meier和log-rank检测比较不同表达的CKS1B和neddylation通路基因的各组内的MM病人的总生存期。结果表明:低表达CKS1B和低表达基因UCB12或UBA3组较任何表达不同的CKS1B和UBC12或UBA3的高低表达组合组的总生存期显著增高。结论过表达CKS1B的MM细胞对Bortezomib耐药,而对MLN4924敏感,MLN4924抑制过表达CKS1B的MM细胞的细胞增殖和生长,降低细胞克隆形成能力,促进细胞发生衰老;不同于Bortezomib,MLN4924能促进P21蛋白稳定,MLN4924通过上调P21的表达发挥对CKS1B过表达MM细胞的治疗作用,敲除P21则显著降低MLN4924的治疗敏感性;相比于健康正常人和MGUS,MM病人浆细胞内NEDD8通路相关基因的表达增加,且预后不佳。总之,我们的研究结果表明,过表达CKS1B的MM细胞对Bortezomib耐药,对MLN4924敏感;且MLN4924是通过抑制P21的降解而稳定上调P21的表达发挥治疗作用;为临床更好的通过NEDD8通路基因而靶向治疗CKS1B过表达的MM奠定基础。