大弹涂鱼(Boleophalmuspectinirostris)是生活于潮间带淤泥滩涂的一种两栖鱼类。课题组前期研究表明,雌性大弹涂鱼生殖群体在繁殖季节出现半月周期的产卵现象,血清中的性类固醇激素、褪黑素、间脑中的褪黑素受体亚型基因mtnr1a1.4和卵巢中的褪黑素受体亚型基因mtnr1a1.7也具有明显的半月周期变化节律,并且半月周期峰值出现的时间与产卵时间基本一致。为了进一步了解大弹涂鱼黑视蛋白与褪黑素以及半月周期产卵习性的关系,本文采用分子生物学等方法克隆了大弹涂鱼四种黑视蛋白基因亚型(opn4m1、opn4x1、opn4x2),研究了其在不同组织、日周期、半月周期和不同季节中的表达情况。并在光学显微镜下观察研究了大弹涂鱼的全脑外部形态结构和组织细胞学特征。主要结果如下:1.大弹涂鱼脑组织可分为前脑、中脑和后脑三大部分。前脑包括了嗅球、端脑以及间脑。大弹涂鱼的端脑较发达且由两半球组成。中脑包括了视顶盖等部分,后脑由小脑和延脑组成。2.opn4m1基因亚型全长为2299 bp,可编码496个氨基酸,5’端有一个621 bp的非编码区,3’端有一个187bp的非编码区;opn4m3基因亚型全长为3381 bp,可编码546个氨基酸,5’端有一个126 bp的非编码区,3’端有一个1614 bp的非编码区;opn4x1基因亚型全长为1588 bp,可编码419个氨基酸,5’端有一个176 bp的非编码区,3’端有一个152 bp的非编码区;opn4x2基因亚型全长为2668 bp,可编码516个氨基酸,5’端有一个900 bp的非编码区,3’端有一个217 bp的非编码区。系统进化分析显示四种黑视蛋白基因亚型属于两大分支:opn4x(Xenopus laevis)和opn4m(Mammalian),并且将四种基因亚型分别命名为opn4m1、Opn4m3、opn4x1、opn4x2。3.荧光定量方法分析结果显示,虽然四种黑视蛋白基因亚型在雌性大弹涂鱼的不同组织中的分布不一样,但在眼睛中黑视蛋白基因亚型的表达量显著高于脑、皮肤、鳃、肾、肌肉、脾、卵巢组织;且肝脏、肠道组织都未检测到四种黑视蛋白的mRNA。4.不论在脑组织或者眼睛中,黑视蛋白的周日变化表达都存在相似特点:在上午(04:30-10:30)都维持低的表达水平;且同一种黑视蛋白基因亚型在不同脑区的周日表达变化并不是完全一致的,特别是opn4m3基因亚型在端脑和间脑出现了相反的两种表达趋势。5.生殖高峰期,雌性大弹涂鱼端脑中黑视蛋白opn4m3和opn4x1亚型基因的表达呈现明显的半月周期表达规律,一个月内有两个周期,在每个周期都出现一个峰值,且峰值出现的时间与大弹涂鱼血清中褪黑素、性类固醇激素峰值出现的时间及产卵时间基本一致;在眼睛和间脑中没有检测到半月周期的表达变化规律。6.荧光定量分析发现,无论是端脑还是间脑,黑视蛋白基因亚型opn4m3和opn4x2在生殖高峰期(5-7月)的表达量都没有显著变化;opn4m1在端脑中的表达量5月份呈现显著的上调,但在间脑中没有显著变化;端脑中opn4x1的表达量在3月的表达量最低,4月的表达量升高(p<0.05),5-6月表达量达到高峰。而在间脑中opn4x1的表达量在4月显著增加后,5-6月表达量却出现降低,7月份表达量又升高。综上所述提示,端脑中的黑视蛋白基因亚型可能是大弹涂鱼半月周期产卵节律的调控因子,光照信息通过端脑传递到HPG轴或直接作用于褪黑素来发挥其调控雌性大弹涂鱼的产卵活动。