研究背景和目的骨质疏松症作为临床上最为常见的骨代谢异常状态,以骨密度下降为主要特点,常常增加患者的骨折风险¨。国外研究提示,高血压病和骨质疏松症存在着密切的联系,绝经期后妇女骨丢失明显加速,骨形成明显不足,而老年高血压病患者体内持续的高血压状态引起血管硬化损伤,加速骨量流失。贝尼地平是临床上常用的L型钙离子通道阻滞剂,在降低血压的同时对成骨细胞有明显的促进成骨作用,但该药物在体环境下的骨代谢作用至今仍未见报道。国内外众多研究报道高血压与成骨异常存在着密切的联系,高血压患者的骨丢失明显加重,而钙从骨质中流失也相应加速,此外高血压引起的继发性骨质疏松近年来成为科学研究的热点问题,为现代骨代谢研究提供了重要线索。贝尼地平(benidipine, BD)作为临床上常用降血压药物,其作用机制主要是抑制血管平滑肌上的L型电压依赖性钙通道蛋白开放,以此阻断钙离子在血管平滑肌细胞中的聚集,从而舒张血管平滑肌并降低血压,但该药物在骨代谢中的研究报道甚少。本研究旨在通过体外实验观察贝尼地平在骨代谢中的具体作用,并探讨其作用机制。骨质疏松症增加骨折风险并引起其他并发症,在临床上愈发常见。在国外的报道中,人们发现高血压患者的骨量丢失非常明显,成骨能力不足,并出现许多骨代谢异常表现。此外,在高血压的动物模型中,人们发现动物甲状腺功能亢进以及促成骨因子缺乏的证据。临床上,40%的绝经后妇女都经历过由于骨质疏松引起的骨折。目前,对抗骨质疏松的方法不多,临床上用于治疗骨质疏松的措施效果有限,因此,对骨质疏松的研究还需进一步深入。骨间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSC)大量存在于骨髓腔中,是成骨细胞和脂肪细胞的前体细胞,并具有分化成神经细胞以及软骨细胞等的潜力。作为研究骨代谢的良好工具细胞,对BMSC成骨分化的干预能明显影响机体的成骨能力,作为成骨细胞的祖细胞,BMSC上发现的成骨证据可对成骨细胞的生理作用产生较大影响。目前,随着对骨代谢研究的深入,药物干预可作为长期手段影响BMSC的成骨分化,为临床上干预骨质疏松提供前期实验依据。贝尼地平作为临床上常用的降血压药物,其主要机制是通过调控血管平滑肌细胞上的L型钙离子通道的开闭,进而调控平滑肌的收缩舒张,最终调控全身血压。作为抗高血压的常用药物,贝尼地平具有持续干预的潜力。此外,目前贝尼地平对骨代谢的在体作用仍不明了,因此,本实验通过观察贝尼地平对BMSC的成骨分化影响,以及贝尼地平灌胃去卵巢C57/BL骨质疏松模型小鼠来探讨钙离子通道阻滞剂对骨代谢的作用及机制。材料和方法1.材料：取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠,体重10-15g,购至内蒙古农业大学实验动物中心；主要实验仪器与试剂：(1)主要仪器：倒置光学显微镜(Nikon, TE2000-U),(2)主要试剂：一抗Runx2 (CST公司),一抗OCN (CST公司),一抗GAPDH (CST公司),一抗β-catenin (CST公司),一抗LRP5 (CST公司),ALP染色试剂盒(碧云天生物试剂公司),Caspase-8比色测定工具包(凯基生物公司),贝尼地平(Sigma公司),α-MEM (Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司)。2.BMSCs的提取与培养小鼠寰枢椎脱臼处死后75%酒精浸泡消毒5分钟,在超净台中用眼科剪和眼科镊剥开小鼠皮肤,从髋臼关节处取下小鼠双下肢,PBS清洗掉粘连毛发,剥离附属肌肉等软组织整理出股骨,浸泡于α-MEM基础培养基中,用一套新的灭菌眼科剪和眼科镊剪开股骨双侧骨端暴露骨髓腔,用1 ML注射器吸取10%FBS的完全培养基冲出骨髓,反复并两端交换冲洗,待骨头发白后将含有骨髓的完全培养基转移至干净的15 ML离心管,800 r/min低速离心5分钟,骨髓重悬后转移至10 cm培养皿中5%的CO2下37℃培养,培养基3天更换1次。3.细胞实验的分组与处理取第3代生长良好的小鼠BMSCs按1×105个/孔密度接种于6孔板,待细胞融合率达到90%以上时,将细胞分为2组,对照组：成骨诱导培养基培养；贝尼地平处理组：成骨诱导培养基条件下分别以1、10和100μmol/L贝尼地平培养。成骨诱导培养基各成分比例为100 nmol/L的地塞米松,50 μg/ml的维生素C磷酸酯,10 mM/L的p-甘油磷酸钠。药物连续处理14天,3天更换1次培养基,37℃,5%CO2条件下培养。4.CCK8检测贝尼地平对BMSCs的细胞毒性第3代BMSCs种于96孔板中,细胞的种植密度为1×105个/孔,培养2天后对细胞进行加药处理,加入贝尼地平浓度分别为0.1、1、10、100和100μmol/L,加药处理1天,使用Caspase-8比色测定工具包(CCK8)进行药物细胞毒性检测。每孔加入10μL的CCK8溶液和90μL的α-MEM基础培养基,使用酶标仪测量各孔吸光度(optical density, OD), CCK8溶液吸收波长为450 nm。5.ALP染色实验第3代BMSCs种于6孔板中,细胞成骨诱导并加入贝尼地平(1～100μmol/L)处理14天后,对细胞行ALP染色。具体步骤为：洗去细胞培养基,使用无菌PBS轻柔冲洗2次,每孔加入2 ml的4%多聚甲醛室温固定20分钟：PBS冲洗3次,每次3分钟,洗掉多余多聚甲醛；按照使用说明书配制ALP染液,现配现用,配好ALP染液避光保存；每孔细胞加入ALP染液1 ML避光37℃孵育半小时；PBS冲洗3遍,每遍3分钟,终止染色。光镜下拍照,Image-Pro Plus software (IPP,美国)软件计数阳性细胞数。6.Western blotting检测Runx2、OCN、GAPDH、β-catenin和LRP5的表达水平对细胞成骨诱导并加入贝尼地平(1～100μmol/L)处理14天后,在冰上用蛋白裂解缓冲液裂解细胞,收集蛋白,样品金属浴96℃处理10分钟,10000 r/min高速离心1分钟,取上清,-20℃长期储存备用。每条泳道上样30μg蛋白,用体积分数(V/V)为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳60分钟,将凝胶中蛋白电泳转移至硝酸纤维素膜上,脱脂奶粉常温封闭1小时后分别加入一抗(1：2000)冰箱4℃过夜孵育,室温TBST溶液清洗3遍,每遍5分钟,二抗(1：3000)常温孵育1小时,增强化学发光(ECL)发光试剂显色摄像。条带用Image J软件分析,测定灰度值。目的条带与对应的GAPDH条带灰度比值为统计结果。7.动物材料雌性10周大C57/BL6小鼠,体重20～23g,购至内蒙古农业大学实验动物中心;主要实验仪器与试剂：(1)主要仪器：倒置光学显微镜(Nikon, TE2000-U),荧光显微镜(Olympus, FV-1000),显微CT (SCANCO Medical, μCT80),石蜡切片机(Leica公司)(2)主要试剂：一抗Runx2 (CST公司),一抗OCN (CST公司),偶联异硫氰酸荧光素山羊抗兔二抗(Abcam公司),伊红(Sigma公司),苏木素(Sigma公司),乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA, Sigma公司),甘油(Sigma公司),余试剂均购至Sigma公司。8.动物饲养与造模随机将30只10周大C57/BL6小鼠平均分为3组,分别为：假手术组(Sham),去卵巢组(OVX),去卵巢加药组(OVX+BD);假手术组切除卵巢周围少量脂肪垫后缝合,去卵巢组完整切除双侧卵巢,去卵巢加药组在完整切除双侧卵巢后灌胃贝尼地平20mg/kg/d,正常饮食,常规饲养3个月,断颈处死后取双侧股骨4℃下4%多聚甲醛固定24小时,EFTA-甘油溶液4℃脱钙1个月。9.组织学检测股骨石蜡包埋,切片(厚度5μm),行伊红苏木素染色,倒置光学显微镜观察股骨下段生长板周围骨小梁数量,拍照。10.显微CT扫描标本固定后行显微CT扫描股骨下段,扫描厚度20μm,骨小梁三维重建后定量骨密度(Bone mineral density, BMD),骨小梁厚度(Trabecular thickness, Tb.Th),骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N)11.免疫组织化学股骨切片脱蜡至水,微波抗原修复10分钟,0.25%Triton X-100室温破膜30分钟,1×TBST清洗3遍,每遍5分钟,5%BSA常温封闭20分钟,RUNX2一抗(1:50)4℃孵育过夜,1×TBST清洗3遍,每遍5分钟,二抗(1:50)室温孵育1小时,1×TBST清洗3遍,每遍5分钟,DAB显色,苏木素复染,倒置显微镜观察,拍照。12.免疫荧光检测股骨切片脱蜡至水,微波抗原修复10分钟,0.25%Triton X-100室温破膜30分钟,1×TBST清洗3遍,每遍5分钟,5%BSA常温封闭20分钟,OCN一抗(1:50)4℃孵育过夜,1×TBST清洗3遍,每遍5分钟,偶联异硫氰酸荧光素山羊抗兔二抗二抗(1:50)室温孵育1小时,1×TBST清洗3遍,每遍5分钟,带DAPI封片剂封片,荧光共聚焦显微镜观察股骨下段荧光强度,拍照。统计学处理实验数据在SPSS 20.0统计软件中运用单因素方差分析。首先行方差齐性检验,若结果方差齐,则组间多重比较采用LSD法；若结果方差不齐组间多重比较采用Dunnett’s法。p<0.05差异具有统计学意义,定量数据均采用均数±方差(X±S)表示。结果1.BD对BMSCs的细胞毒性影响加药处理1天后,对细胞行CCK8检测,结果提示BD浓度在1～100μmol/L时对细胞均不会出现毒性作用(p>0.05),各实验组(1～100μmol/L) CCK8结果和对照组相比差异无统计学意义(p>0.05,图1,表1)。2.BD对BMSCs的ALP表达影响细胞处理14天后,行ALP染色,光镜下拍照用IPP软件计阳性细胞数。对照组：88.93183±13.84093,1μmol/L组：120.2671±24.90133,101μmol/L组：133.6373±20.98523,100 μmol/L组：174.4387±15.34316,各组组间比较差异具有统计学意义(p<0.05,图2,表1),随着BD浓度的增加,ALP阳性细胞数相应明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.BD对BMSCs的Runx2和OCN表达影响细胞处理14天后行蛋白免疫印迹检测Runx2表达量,对照组：1.054064±0.1719727,1μmol/L组：1.634447±0.1609285,10μmol/L组：2.116751±0.2348296,100nmol/L组：2.924276±0.1659721,各组组间比较差异具有统计学意义(p<0.05,图3,表1),随着BD浓度的增加,Runx2表达相应明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。同样,对细胞行蛋白免疫印迹检测OCN表达量,对照组：1.094875±0.09158855,1μmol/L组：1.667254±0.08221544,10μmol/L组：1.984705±0.1669997,100μmol/L组：2.586582±0.2274695,各组组间比较差异具有统计学意义(p<0.05,图3,表1),随着BD浓度的增加,OCN表达也相应明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.BD对股骨下段生长板周围骨小梁的组织学影响股骨下段行HE染色(图1)发现,BD能明显抑制由于去卵巢引起的骨质疏松。和单纯去卵巢组(图1,表1)小鼠的股骨下段生长板周围骨小梁相比,去卵巢加药组小鼠的骨小梁数量明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05),但仍然低于假手术组小鼠(图1,表1),差异具有统计学意义(p<0.05)。5.BD对股骨下段骨代谢参数的影响股骨下段显微CT扫描(图2)发现,和去卵巢加药组小鼠(图2,表1)相比,去卵巢组小鼠的BMD、Tb.Th、Tb.N均明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)；而各组中假手术组(图2,表1)的BMD、Tb.Th和Tb.N最高,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.BD对股骨下段RUNX2表达的影响对各组股骨下段行RUNX2免疫组织化学染色(图3)发现,去卵巢加药组(图3,表1)股骨下段RUNX2阳性细胞数量明显多于单纯去卵巢组(图3,表1),差异具有统计学意义(p<0.05)；而假手术组(图3,表1)RUNX2表达量在各组中表达最强,差异具有统计学意义(p<0.05)。7.BD对股骨下段OCN表达的影响各组小鼠股骨下段OCN免疫荧光染色(图4)发现,去卵巢加药组(图4,表1)股骨下段OCN表达明显高于单纯去卵巢组(图4,表1),差异具有统计学意义(p<0.05),但仍低于假手术组(图4,表1),差异具有统计学意义(p<0.05)。8.BD对WNT/β-catenin信号通路影响细胞处理14天后行蛋白免疫印迹检测β-catenin表达量,对照组：1.014551±0.0531498,1μmol/L组：2.090139±0.1359573,10μmol/L组：3.444125±0.4555160,100μmol/L组：4.381943±0.4081259,各组组间比较差异具有统计学意义(p<0.05,图4,表1),随着BD浓度的增加,β-catenin表达相应明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。同样,对细胞行蛋白免疫印迹检测LRP5表达量,对照组：0.9906217±0.04400716,1μmol/L组：1.611732±0.09187134,10μmol/L组：1.864968±0.09601978,100μmol/L组：2.474474±0.1582388,各组组间比较差异具有统计学意义(p<0.05,图4,表1),随着BD浓度的增加,LRP5表达也相应明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论随着我国人口老龄化程度加剧,国民心血管问题越发突出,高血压病的发病率以及患者数呈逐年上涨趋势,给社会、家庭和个人带来沉重经济负担。此外,国外临床证据提示体内长期高血压状态和骨代谢异常存在着密切联系,这为我们提供了一个解决高血压病和骨代谢异常疾病的良好思路,能否在降血压药物中找到一种良好的缓解骨质疏松症的药物是本次研究的主要目的。贝尼地平作为L型钙离子通道阻滞剂,通过调控细胞内的钙通道进而调节血管平滑肌的收缩,但贝尼地平在其他靶细胞的具体作用目前研究不多。骨髓间充质干细胞作为成骨细胞的祖细胞,调控着体内成骨发育的关键过程,但贝尼地平对骨髓间充质干细胞的具体作用目前尚不清楚,明确贝尼地平对骨髓间充质干细胞在成骨分化过程中的影响,对临床上如何干预骨折愈合、抗骨丢失有重要意义。贝尼地平作为临床上用的降压药,具有L型、N型和T型三亚型通道阻滞作用,可舒张血管,能降低血压和增加冠脉流量。国外的一些体外实验明确了贝尼地平促进成骨的作用,但具体机制尚不清楚,另外,贝尼地平在体内的作用是否和以往的体外实验相吻合目前尚不得而知。本课题旨在在体内环境下探讨贝尼地平对骨代谢的影响,为临床上绝经期后高血压合并骨质疏松患者的治疗提供新颖的治疗策略。本实验采用体外诱导原代骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞技术来探讨贝尼地平对成骨分化的影响,骨髓基质干细胞作为骨代谢中重要的祖细胞,是成骨细胞、脂肪细胞等共同的来源细胞,地位重要[23]。本研究首先通过酶标仪法检测贝尼地平对骨髓基质干细胞的毒性作用,在实验设置的贝尼地平浓度范围内(1～100μmol/L)未发现骨髓间充质干细胞出现毒性反应(p>0.05),这为我们下一步的实验研究提供了重要参考。此外,碱性磷酸酶作为成骨细胞的标志性蛋白,在成骨细胞鉴定、成骨功能实现等过程中作用巨大。在成骨诱导条件下加药培养14天后的中期成骨阶段,我们发现在实验组中各浓度(1～100μmol/L)的碱性磷酸酶表达和对照组相比都是明显增加的(p<0.05),此外,在实验组(1～100μmol/L)的组内比较中我们发现,随着贝尼地平的浓度增大,碱性磷酸酶的表达和阳性细胞数呈浓度依赖性增加(p<0.05),提示贝尼地平对成骨细胞中碱性磷酸酶的表达具有明显促进作用。另外,为进一步探讨贝尼地平对成骨分化的分子生物学影响,我们对处理14天后的细胞行蛋白免疫印迹检测,探究成骨分化过程中关键转录因子Runx2和重要成骨调控蛋白OCN表达量,本研究发现贝尼地平通过促进成骨细胞中关键转录因子Runx2的表达进而促进成骨细胞分化进程,在各实验组(1～100μmol/L)中,OCN的表达均高于对照组(p<0.05),并呈现浓度依赖性(p<0.05),从成骨调控蛋白角度印证了贝尼地平对成骨分化的作用；另外,成骨过程中关键转录因子Runx2表达在贝尼地平的作用下明显增加,在实验组中(1～100μmol/L)Runx2表达量明显高于对照组(p<0.05),随着贝尼地平浓度增加,Runx2表达明显增加的(p<0.05),从核转录因子水平发现贝尼地平促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Wang Bai-xiang等人在成骨细胞株MC3T3-E1中发现贝尼地平促进ALP、Runx2和OCN表达。骨髓间充质干细胞作为成骨细胞的上游细胞,其成骨能力改变对骨代谢的影响更为巨大,本研究则从干细胞层面发现贝尼地平对成骨作用的影响。为进一步探讨贝尼地平对骨髓间充质干细胞成骨分化的信号通路机制,本研究对成骨诱导并加药培养14天后的细胞行蛋白免疫印迹检测,探究WNT/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin和LRP5的表达水平。WNT/β-catenin信号通路是成骨细胞分化和成熟的关键通路,前人实验结果提示在β-catenin参与情况下,骨髓间充质干细胞才具有向成骨细胞分化的能力。在本实验中,贝尼地平的加入能上调β-catenin表达,和对照相比,实验组(1～100μmol/L)的β-catenin表达量均明显增加(p<0.05),实验组(1～100μmol/L)内β-catenin的表达随贝尼地平增加而增加(p<0.05);另外,作为WNT/β-catenin信号通路中重要的通路活性调控蛋白,LRP5表达随着贝尼地平加入而明显上调(p<0.05),并呈现明显的浓度依赖性(p<0.05)。由以上结果我们不难看出,β-catenin和LRP5作为WNT/β-catenin信号通路内关键正性调控蛋白,其表达量的上调提示WNT/β-catenin信号通路强度明显增强,从信号通路方面阐述贝尼地平促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的机制。此外本验通过去卵巢模仿绝经期后妇女骨质疏松模型,探讨在雌激素水平缺乏情况下,贝尼地平对小鼠骨代谢的影响。本研究通过组织学检测以及股骨下段显微CT扫描,通过假手术组和去卵巢组小鼠股骨下段的骨小梁数量和骨代谢参数对比,发现去卵巢组小鼠相关参数均明显下降,可验证骨质疏松造模成功；另外,通过单纯切卵巢组和切卵巢加药组小鼠骨代谢相关指标对比,可发现切卵巢加药组各项指标均优于单纯切卵巢组,明确了贝尼地平对股骨下段骨小梁数量的影响以及促进骨代谢参数的恢复,去卵巢加药组的小鼠股骨下段骨小梁作色区域明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05),骨密度、骨小梁厚度及骨小梁等定量指标和单纯去卵巢小鼠相比均明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05),可以明确在体内环境下,贝尼地平具有对抗雌激素水平下降的骨质疏松作用。为进一步探讨贝尼地平在体条件下促进骨形成的具体分子生物学机制,本课题对股骨下段石蜡切片进行了成骨关键蛋白OCN和重要转录因子RUNX2免疫荧光以及免疫组织化学检测。OCN是成骨细胞特性的调控蛋白,在成骨细胞成熟和分化过程中起着至关重要的作用,来自胞外促进成骨的信号分子通过膜受体的信号方法及细胞质中的第二信使信号转导,将明显上调胞核内OCN的表达,进而上调成骨相关蛋白质的转录与表达,促进成骨并调节骨的矿化及成熟[25],通过OCN免疫荧光染色发现贝尼地平加药组小鼠股骨下段生长板周围OCN表达明显高于单纯切卵巢组,差异具有统计学意义(p<0.05),但仍低于假手术组小鼠,差异具有统计学意义(p<0.05)；此外,成骨细胞重要的转录因子RUNX2是胞质中广泛分布的促进成骨的转录因子[26],RUNX2的表达受WNT/β-catenin信号通路直接调控,而WNT/β-catenin是成骨细胞行使生物学功能最为重要的信号通路,因此,RUNX2表达的增加可间接反映WNT/β-catenin信号通路的活性;本实验中我们发现,在去卵巢组小鼠的股骨下段RUNX2表达量明显低于假手术组和去卵巢加药组,因此,不难看出,贝尼地平体内通过成骨重要转录因子RUNX2促进成骨,在分子生物学水平上揭示了贝尼地平促进成骨的机制。贝尼地平作为临床上常用的心血管药物,其降血压特性已得到广泛运用,国外已有部分研究报道贝尼地平对成骨细胞的促进作用。在此背景下,本研究以骨髓基质干细胞为研究切入点,从成骨细胞的祖细胞水平在体外环境下探讨贝尼地平对骨代谢的具体作用,并阐述了本过程的信号通路机制,为临床上贝尼地平的全新运用提供实验依据。临床上骨质疏松症作为骨代谢异常最常见的病症,为家庭了社会带来了沉重负担,另外,高血压合并骨质疏松在临床上也较为常见,绝经期后妇女在卵巢功能明显衰退阶段,骨量的丢失导致骨折风险增加,以上种种因素均促使临床工作者寻找对抗高血压和骨质疏松的良好方法,本实验希望对此艰巨任务提供一些基础实验依据,但贝尼地平在体促进成骨的深沉及时需要进一步探讨。