脂溶性羧酸化合物普遍存在于生物体内,参与了一系列重要的生理学过程。与许多疾病的发生、发展密切相关。因此,实现脂溶性羧酸化合物的高灵敏度、高准确度分析在生理学研究和疾病诊断方面具有重要的意义。质谱法由于具有灵敏度高、选择性好的特点是目前脂溶性羧酸化合物分析的主流方法。目前液相色谱-质谱技术已被广泛用于脂溶性羧酸的目标性绝对定量分析,但对生物体内脂溶性羧酸化合物的非目标性研究仍然很少。由于脂溶性羧酸结构上通常只含有羧酸基团,因此在质谱分析时离子化效率差。因此,在检测时会面临定性灵敏度低、定量不准确、检测范围有限等问题。基于衍生化技术,近年来发展了稳定同位素标记技术,并被用于代谢组学研究中。该方法是将一对含有同位素标记试剂分别对两组样品进行标记,混合后进行LC-MS分析。该方法通过向目标物分子上引入易电离基团、亲水性基团和同位素标签,以增强电喷雾离子化效率、改善色谱分离、提高分析准确性。在本次研究中,我们将稳定同位素标记技术与质谱技术相结合,运用不同的质谱扫描模式对脂溶性羧酸化合物进行定量和非目标性定性分析。所建立的方法显著提高了脂溶性羧酸的检测灵敏度和准确度,扩大了脂溶性羧酸的检测范围。研究内容主要包括以下几个方面:一、目标性脂肪酸代谢物分析研究:(1)建立一种高灵敏度的稳定同位素标记串联超高效液相色谱质谱技术(IL-UHPLC-MS/MS)对多种生物样品中花生四烯酸细胞色素P450代谢物进行绝对定量分析。其中,N,N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-DMED被用来标记类花生酸。d4-DMED标记的类花生酸标准品作为内标校正基质效应。经过DMED标记后,类花生酸在标准溶液中的检测灵敏度显著提高约3-108倍。利用苯基柱,我们实现了 19个类花生酸同分异构体的分离。该方法适用于大鼠肝脏、心脏、脑组织和人体血清中类花生酸的分析。结果显示,19个类花生酸中11-、15-、16-、20-HETE、5,6-EET和14,15-EET在二型糖尿病人血清中有显著差异,5-、11-、12-、15-、16-、20-HETE、8,9-EET 和 5,6-DHET 在髓系白血病人体内有显著性差异,说明这些类花生酸与二型糖尿病和髓系白血病有关。(2)建立了阴离子交换固相萃取结合稳定同位素标记串联超高效液相色谱质谱技术(SAX-SPE-IL-UHPLC-MS/MS)对生物样品中16种支链脂肪酸酯化羟基脂肪酸(FAHFAs)进行分析。利用SAX小柱与目标分析物之间的阴离子交换作用,有效的提取和纯化生物样品中的FAHFAs。经DMED标记后,FAHFAs的检出限达到0.01-0.14 pg,相较于已报道方法灵敏度提高了约两个数量级。通过利用UHPLC系统,FAHFAs异构体分离分辨率得到提高。利用该方法,我们成功的在大鼠组织和人体血清中检测到7种内源性的FAHFAs。我们发现13-、9-PAHSA、13-和12-SAHSA在乳腺癌血清样品中显著降低,说明FAHFAs可能与乳腺癌的形成发展过程有关。2、脂溶性羧酸的非目标性代谢组学研究:(1)中性丢失扫描和多重反应监测是三重四级杆质谱特有的两种扫描模式。在该方法中,我们将稳定同位素标记技术与四重中性丢失(QNLS)和多重反应检测模式(MRM)相结合,对二型糖尿病和正常人血清中的脂溶性羧酸化合物进行全分析和相对定量分析。DMED和d4-DMED被用于选择性的标记脂溶性羧酸化合物。在碰撞诱导解离下,DMED和d4-DMED标记的产物会产生45/49 Da或63/67 Da的中性丢失。因此,四重中性丢失扫描模式被用于脂溶性羧酸的非目标性分析。我们将两个中性丢失扫描谱中保留时间一致、强度一致并且有特定分子量差的离子对筛选出来,作为潜在的脂溶性羧酸化合物。利用IL-LC-QNLS-MS方法,我们在人体血清中一共发现了 241个脂溶性羧酸化合物,其中有21个可以被标准品准确定性。随后我们建立了 IL-LC-MRM-MS方法并将其用于相对定量分析。在二型糖尿病和健康人血清中,一共有81个脂溶性羧酸化合物存在显著性差异。(2)我们建立了一种稳定同位素标记结合线性离子肼串联轨道肼质谱的方法(IL-LC-LTQ-OrbitrapMS),对小鼠粪便中的脂溶性羧酸化合物进行非目标性全分析。在小鼠粪便样品中,我们发现853个潜在的脂溶性羧酸化合物,极大的扩大了小鼠粪便中脂溶性羧酸化合物的研究范围。利用LTQ-OrbitrapMS串联质谱的功能,探索了四种数据依赖采集模式,对脂溶性羧酸进行MS2和MS3分析,提高了代谢组学分析的定性能力。在853个潜在脂溶性羧酸化合物中,一共有83个化合物可以由标准品准确定性,有16个化合物可以由多级质谱解析而推定,还有447个可以通过搜索METLIN代谢库而获得。