论文部分内容阅读
目的:携带绿色荧光蛋白报告基因RKIP质粒(pGFP-RKIP)稳定转染食管癌TE-13细胞,体外研究过表达RKIP对食管癌TE-13细胞增殖和迁移的影响。 方法: 1 RT-PCR方法检测四种食管癌细胞TE-2,TE-13,YES-2,YES-4中RKIPmRNA的表达水平,筛选出低表达细胞TE-13,进行RKIP质粒转染。 2携带绿色荧光蛋白报告基因RKIP质粒(pGFP-RKIP)和空质粒(pGFP)转染食管癌细胞TE-13,经G418筛选后,进行RT-PCR和Western-blot方法鉴定,获得稳定转染空载体和过表达RKIP蛋白的细胞克隆。 3应用平板克隆形成实验观察过表达RKIP对食管癌TE-13细胞克隆能力的影响。 4用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测过表达RKIP对食管癌细胞TE-13增殖能力的的影响。 5流式细胞术(FCM)检测过表达RKIP对食管癌细胞TE-13的细胞周期和凋亡的影响。 6细胞划痕法检测过表达RKIP对食管癌细胞TE-13体外迁移能力的影响。 结果: 1食管癌细胞RKIP mRNA在TE-2,TE-13,YES-2,YES-4表达水平分别为1.254±0.057,0.537±0.004,1.187±0.008,1.162±0.007,TE-13表达水平最低。pGFP-RKIP质粒和空载体pGFP质粒转染人食管癌TE-13细胞,经G418筛选,获得稳定转染pGFP-RKIP细胞,以RT-PCR检测RKIPmRNA表达水平,在未处理组、pGFP组和pGFP-RKIP组的表达水平分别为0.201±0.023、0.384±0.012和1.211±0.028;经Western blot方法检测RKIP蛋白表达水平分别为0.401±0.005,0.389±0.006和1.501±0.004;结果显示,筛选出过表达RKIP的细胞株pGFP-RKIP,pGFP-RKIP细胞中RKIP mRNA和蛋白的表达均显著高于未处理组和空质粒对照组(P<0.05),未转染组和空质粒对照组RKIP mRNA和蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。 2平板克隆形成实验结果显示:pGFP-RKIP质粒转染组的细胞克隆形成率43.50±1.87%显著少于pGFP质粒转染对照组78.83±2.78%,有显著性差异(P<0.05)。MTT结果示:从第2天开始,pGFP-RKIP质粒转染组细胞生长显著慢于pGFP空质粒对照组(P<0.05)。 3 FCM示,pGFP-RKIP转染组细胞的凋亡率为0.91±0.14%,空质粒pGFP对照组细胞的凋亡率为0.73±0.12%,两组细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05)。pGFP-RKIP转染组G0/G1期细胞比例为51.4±0.12%,明显高于空质粒对照组33.5±0.07%(P>0.05),S期细胞pGFP-RKIP质粒转染组比例为31.5±0.10%,明显比空质粒对照组pGFP细胞50.48±0.12%减少,差异有显著性(P<0.05)。 4平板单层细胞划痕实验显示,划痕12小时,pGFP-RKIP转染组细胞和pGFP空质粒对照组对照组细胞分别迁移27.8±1.7%和58.5±3.9%,划痕24小时分别迁移51.0±13.2%和94.1±2.6%,差异有显著性(P<0.05)。 结论: 1高侵袭性食管鳞癌TE-13细胞中RKIP mRNA表达水平低,提示RKIP的低表达可能与食管癌的发生,转移等恶性行为有关。 2 RKIP基因成功转入食管癌TE-13细胞,筛选出过表达RKIP的细胞株pGFP-RKIP。RKIP基因转染后,食管癌TE-13细胞体外克隆形成率、增殖率、迁移速率明显降低,说明过表达RKIP能抑制TE-13食管癌细胞的体外增殖和细胞迁移,过表达RKIP将TE-13细胞阻滞于G0/G1期,影响细胞的周期,而对细胞凋亡无明显影响。