肺癌是目前最严重的癌症相关死亡疾病之一,在我国发病率和死亡率更是高居恶性肿瘤之首,并且增长迅速,严重威胁人类健康和生命。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）作为肺癌最主要的组织学类型,约占所有肺癌的85%,其中约80%的NSCLC患者在中晚期伴有转移。近年来,随着对肺癌发病机制的深入探究,分子靶向治疗及免疫治疗已成治疗NSCLC的研究热点,尤其是EGFR（Epidermal growth factor receptor）、ALK（Anaplastic lymphoma kinase）和 NTRK（Neuro trophin receptor kinase）等分子抑制剂以及 PD-1（Programmed cell death-1）、PD-L1（Programmed cell death-ligand 1）等免疫检查点抑制剂的成功应用,在晚期NSCLC治疗方面取得了突破性进展。但是由于NSCLC高度的异质性和复杂性,对于大多数患者确诊时已处于中晚期则仍缺少有效治疗手段,分子靶向治疗和免疫治疗对改善晚期NSCLC患者的生存期作用仍然十分有限。因此深入研究NSCLC发生发展的具体分子机制,对进一步探寻关键的诊断和治疗靶点,实现NSCLC患者的个体化“精准”治疗具有重要意义。G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）家族在生理功能中发挥核心作用,与人类许多疾病密切相关。目前GPCRs介导的信号转导在肿瘤发生、血管生成、免疫逃逸、肿瘤转移和耐药等诸多方面的作用日益突显。GPCRs被认为是肿瘤最有潜力的治疗靶点之一。G蛋白偶联胆汁酸受体（G protein-coupled bile acid receptor,GPBAR）是胆汁酸的膜受体,作为“肝脏-胆汁酸-微环境-器官”轴的核心组分,参与调节代谢和炎症等多种病理生理过程,GPBAR已成为一系列代谢和炎症疾病的重要治疗靶点。目前,越来越多的研究发现GPBAR在不同恶性肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色。例如,GPBAR可以通过调节不同信号通路,促进结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、食管癌和子宫内膜癌细胞的增殖。但是也有研究认为GPBAR可以抑制肿瘤的发生和发展。比如在肝癌和肾癌中,GPBAR的激活可以抑制癌细胞的增殖和迁移,并促进其凋亡。还有相关研究报道,即使在相同的肿瘤类型中,由不同配体激活的GPBAR也可能发挥不同的促肿瘤或抗肿瘤作用。上述研究提示:GPBAR在不同的肿瘤组织类型或细胞环境中发挥不同的调控作用。目前,GPBAR在NSCLC中的作用研究比较有限。有研究报道:GPBAR在NSCLC中高表达,干扰GPBAR可以抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。但是,不同配体激活的GPBAR在NSCLC中的具体功能、分子机制及其潜在诊疗价值尚未阐明。本研究对不同配体激活GPBAR在NSCLC中的作用、作用机制和结构基础进行了深入研究,主要方法与结果如下:1.不同配体激活GPBAR后差异性调控NSCLC细胞恶性表型为了探讨GPBAR在NSCLC恶性表型中的作用,我们首先通过免疫组织化学实验检测NSCLC患者组织和癌旁组织标本中GPBAR的表达情况,结果显示,GPBAR在NSCLC组织中高表达,并且与临床TNM（Tumor node metastasis）分期呈正相关。同时,我们分别在GPBAR不同表达水平的NSCLC细胞系中干预GPBAR的表达,通过MTT（3-（4,5-dimethylthiazole-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide）、流式细胞术和TUNEL（Terminal dUTP nick-end labeling）实验检测 GPBAR 对 NSCLC 细胞增殖和凋亡的影响。结果发现,过表达GPBAR可以显著促进NSCLC细胞增殖;沉默GPBAR则抑制NSCLC细胞增殖并促进细胞凋亡。为了确定GPBAR活性改变对NSCLC细胞表型的影响,我们分别应用不同浓度的GPBAR内源性胆汁酸和外源合成的胆汁酸衍生物处理NSCLC细胞系,检测在不同配体刺激下NSCLC细胞增殖能力的差异。结果发现,CA（Cholic acid）、LCA（Lithocholic acid）、DCA（Deoxycholic acid）、UDCA（Ursodeoxycholic acid）和 INT-777（6alpha-Ethyl-23（S）-methylcholic acid）激活 GPBAR 后抑制细胞增殖,而 CDCA（Chenodeoxycholic acid）、TCA（Taurocholic acid）、TDCA（Tauroursodeoxycholic acid）、GCA（Glycocholic acid）、P395和R399可以显著促进细胞增殖。我们选取具有抑癌作用的配体INT-777以及发挥促癌作用的R399作为研究对象,通过MTT实验、流式细胞术和TUNEL实验分别检测它们对NSCLC细胞恶性表型的影响。结果显示,INT-777抑制细胞增殖,并显著诱导细胞凋亡;而R399具有较强的促增殖作用。裸鼠异种移植瘤实验进一步证实了 INT-777和R399对NSCLC细胞生长和凋亡的差异性调控作用。以上结果表明INT-777 和 R399 激活的 GPBAR 在调控 NSCLC 细胞恶性表型 中发挥不同的生物学作用。2.INT-777和R399通过双向调节YAP信号差异性调控NSCLC细胞的恶性表型为了进一步探究INT-777和R399激活GPBAR产生差异性生物学效应的分子机制,我们通过RNA-seq及生物信息学方法筛选INT-777和R399调控的下游信号通路。结果发现,INT-777能显著抑制YAP（Yes-associated protein）通路而R399促进YAP通路的活化。我们进一步检测了 YAP转录活性、YAP磷酸化水平及亚细胞定位情况,验证了上述配体对YAP信号通路的差异性调控作用。同时,细胞功能实验也显示,过表达YAP可以显著抑制INT-777诱导的细胞凋亡,而沉默YAP的表达或抑制其活性可以逆转R399对H1299细胞增殖能力的促进作用。这些实验结果提示,INT-777通过抑制YAP活性发挥抑癌作用,而R399激活YAP活性发挥促癌作用。3.INT-777和R399通过偏好性信号转导（Gs vs.β-arrestin）差异性调控YAP活性和NSCLC细胞恶性表型为了探究INT-777和R399激活GPBAR差异性调控YAP活性和细胞恶性表型的机制,我们探究了INT-777和R399的偏好性信号转导。通过Glo-SensorTM cAMP实验、Gα-Gγ解离实验、β-arrestin招募实验发现,INT-777结合GPBAR后偏向激活Gs信号通路,而R399结合GPBAR后能够偏向激活β-arrestin信号通路。YAP活化检测及细胞功能实验显示,沉默或抑制Gs后,INT-777对YAP活性和细胞增殖的抑制作用显著降低,而干扰β-arrestin 1后,R399激活YAP通路进而促进细胞增殖的作用受到明显抑制。以上结果说明,INT-777和R399通过驱动不同的GPBAR偏好性信号通路差异性调控YAP活性,从而在调控NSCLC细胞的恶性表型中发挥截然不同的作用。G蛋白偶联受体激酶（G protein coupled receptor kinase,GRK）诱导的GPCRs磷酸化在GPCR-β-arrestin信号通路中发挥重要作用。但是GRKs在调节GPBAR功能和磷酸化方面的具体作用尚不清楚。本研究探讨了不同GRKs亚型在R399驱动的GPBAR-β-arrestin 信号通路的作用。通过 qRT-PCR 和 BRET（Bioluminescence resonance energy transfer）实验发现,GRK2和GRK5在R399诱导的GPBAR-β-arrestin 1招募中发挥关键作用。利用双荧光素酶报告基因实验和MTT实验发现,GRK2或GRK5沉默均降低了 R399诱导的YAP转录活性和细胞增殖作用。此外,本研究还通过质谱鉴定出R399诱导GRK2磷酸化GPBAR的潜在位点（S310、S321、S323和S324）。4.GPBAR介导偏好性信号途径的结构基础为了解析GPBAR介导偏好性信号途径的结构基础,我们在体外重组R399-GPBAR-Gs信号转导复合物,利用单颗粒冷冻电镜技术解析了 R399-GPBAR-Gs的高分辨率结构。通过对R399-GPBAR-Gs结构分析以及利用Cα原子上的均方根差（Root-mean-square-deviations,RMSD）分析 R399 和 INT-777 激活 GPBAR 结构之间的构象差异。结果显示,构象差异集中在ECL1、ECL2以及ICL1。随后我们将存在显著构象差异的氨基酸分别进行丙氨酸突变,检测对下游Arrestin和cAMP的影响。结果发现,R44ICL1、L45ICL1、Q77ECL1和P151ECL2突变后导致Arrestin招募显著减少。此外,MTT实验显示,P151A突变后消除了 R399促进细胞增殖作用,提示上述氨基酸在GPBAR招募β-arrestin 1中发挥关键作用。总之,我们的研究揭示了 INT-777和R399驱动的GPBAR偏好性信号转导（Gs vs.β-arrestin）差异性调控YAP活性,从而影响NSCLC恶性表型的分子机制,解析了R399激活GPBAR偏好β-arrestin 1信号的结构基础,为丰富GPBAR信号转导在NSCLC发生发展中的作用奠定理论基础,同时也为探索NSCLC诊断和治疗靶点提供新的方向。