哺乳动物Toll like receptors(TLRs)是果蝇Toll的同系物，它们构成一个新的蛋白家族，参与天然免疫的介导和获得性免疫的激活。自1997年发现第一个哺乳动物TLRs以来，现已发现了小鼠的TLRs有9个(即mTLR1-9)；人的TLRs有10个(即TLR1-10)中。研究表明，TLRs家族的作用并不仅限于抗感染免疫，还可参与抗原递呈、诱导免疫耐受、细胞凋亡，并以此在自身免疫病、超敏反应、移植排斥及肿瘤免疫中发挥作用。在过去几年中，TLR-2作为脊椎动物蛋白TLR家族的一员，得到广泛的研究。TLR-2可介导多种不同的病原微生物(尤其是革兰氏阳性菌、分枝杆菌及螺旋体等)及其产物引起的、性质相似的细胞信号转导活动及细胞因子产生。因此,TLR-2被认为是具中心作用的或中枢型识别(central pattern recognition)受体。尽管有许多体外实验证实了TLR-2参与免疫相关事件，但是来自体内实验关于TLR-2功能的数据很少。 小鼠和人的TLR-2都是果蝇TLR-2的同源蛋白，两者在氨基酸水平上有83％的同源性。基于mTLR-2与hTLR-2结构的高度同源性，及在分布、生物学活性方面的诸多相似，小鼠无疑是研究TLR-2结构、功能及其结合肽特性的良好模型。本研究拟对小鼠TLR-2进行克隆、表达及其抗体的生物活性研究。首先对小鼠TLR-2的全基因及部分基因进行克隆、表达；制备抗mTLR-2胞外段B细胞识别表位抗体；在获得了抗mTLR-2抗体的基础上，进行抗mTLR-2抗体抗过敏和肿瘤抑制实验，从整体水平上来研究TLR-2的生物学功能。 第一部分 mTLR-2基因的克隆及在不同体系中的表达 根据已发表的mTLR-2的全基因序列，采用Primer premier 5.0软件，设计并合成以下两对引物。以P2,P4为引物，以Balb／c小鼠肝脏eDNA为模板的PCR反应，扩增出约1500bp特异性扩增带，而以P1,P3为引物的PCR反应，扩增出约1400bp特异性扩增带通过蓝白斑筛选挑选，并经PCR和测序鉴定，分别获得上游阳性克隆U3和下游阳性克隆D4。以u3、04为模板，以PZ，P4为引物的pCR反应，扩增出约2 soobp特异性扩增带，将其克隆至puCm一T载体中，经PcR和测序鉴定，获得puc一mTLR一2重组质粒。经测序鉴定，表明获得mTLR一2基因，该序列已被GenBank收录(AY179346)，与已发表的mTLR一2的同源性为99.84%。在线运行BLASTZ，AY179346与标准mTLR一2 eDNA序列AF124741之间有4个碱基的差别。分别是515位由t变为c，963位由t变为c位，2476位由a变为g，2500位由t变为。由AY179346推导而来的氨基酸与AF 124741所编码的氨基酸序列比较，有3个氨基酸的差异，分别是F266L，Q770R，L778P。 从体外获取mTLR一2蛋白，对于从细胞模型及动物模型进行TLR一2的研究具有重要意义。选用哺乳动物CHO细胞表达系统、毕赤酵母表达系统及大肠杆菌原核表达系统对全长及部分mTLR一2基因进行表达研究。(l)将目的基因克隆到真核表达载体peDNA3 .1中，成功构建了PcDNA一mTLR一2重组质粒，并将其转染到CHo细胞，用G418筛选阳性克隆。PCR检测表明外源基因得到稳定整合，Westem blot分析显示在分子量约95 000处可见清晰的阳性反应条带。免疫组织化学和流式细胞术检测显示转染细胞表达mTLR一2。(2)将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPICZac中，获得重组质粒pPIcz一mTLR一2，采用电穿孔法转化毕赤酵母。重组酵母以PeR、RT一PCR验证，sDs一AGE和Westem blot分析显示，在相对分子量为约97 000处有1特异蛋白带，且能与抗mTLR一2多抗发生反应。(3)采用PcR技术，扩增编码mTLR一ZN端153氨基酸的基因，并将其克隆到pET32a载体中，成功构建了融合表达载体pET一，融合蛋白在大肠杆菌中高效表达，采用Probond树脂柱纯化融合蛋白。第二部分抗mTLR一2胞外段抗体的制备与鉴定 制备两种抗mTLR一2胞外段抗体。(1)在对小鼠Toll样受体2(mTLR一2)B细胞优势表位预测的基础上，合成B细胞识别表位20mer短肤，将其与载体蛋白偶联，制备免疫原。经ELISA方法检测抗体滴度为1:25 600，采用spG柱纯化法获得兔抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位多克隆抗体TSP一1;采用抗原肤亲和层析纯化法获得兔抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位抗体TSP一2。Westem blot分析显示在相对分子量约95 000处可见清晰的反应条带;免疫组织化学和流式细胞术检测显示抗体可与表达天然mTLR一2的J774A.1细胞反应。(2)将已获得的N端融合蛋白免疫动物，获取抗mTLR一2多表位抗体。经ELISA方法检测抗体滴度为1:16 000，采用spG柱纯化法获得兔抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位多克隆抗体TsP一3。流式细胞术检测显示TsP一3可与25.5%的CHO一mTLR一2细胞反应。第三部分抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位抗体抑制肉瘤生长的研究 以小鼠肉瘤株5180细胞注射小鼠左后肢，其中TSP一l组混合有100雌纯化抗体TSP一1，RlgG组混合有100雌正常兔lgG，Sahne组仅接种5180。小鼠经麻醉分别于10d、14d、18d处死，TSP一l组瘤重在10d、14d、18d与Saline组相比差异显著(p<0.02、p<0.05、P<0.05);抑瘤率分别为77%、51%和53%。局部应用抗mTLR一2胞外段B细胞识别表位抗体可抑制小鼠肉瘤5180生长，且主要表现在肿瘤生长的早期。