真菌细胞壁是真菌的重要器官，在保护真菌、抵抗外界不良环境以及真菌生长、发育等过程中起着不可替代的作用。真菌细胞壁主要由多糖（葡聚糖，几丁质，甘露聚糖)和糖蛋白组成。目前的研究对真菌细胞壁合成相关的酶报道较多，而对细胞在生长期间进行重建和的扩展所需要的水解酶类报道较少。葡聚糖苷转移酶具有水解和转移酶的活性，在酵母中有延长1,3-β-葡聚糖链或以1,6-β-糖苷键与1,3-β-葡聚糖链连接形成分支链的作用。然而，葡聚糖苷转移酶的生物学功能即该基因在真菌生长发育、侵染、抗逆等过程中的作用尚不十分清楚。为明确其功能，本项目以绿僵菌（Metarhizium acridum，Ma）为试验材料，采用基因敲除技术构建了葡聚糖苷转移酶Mwg1的敲除菌株，并通过形态观察、生物毒力测定、细胞壁多糖成分测定、抗逆性表型观察等对其进行了功能分析。主要研究内容：1.采用生物信息学方法分析Mwg1的基因结构与功能。从GenBank中搜索出Mwg1的基因组序列和氨基酸序列；将Mwg1序列在NCBI上进行Blast比对，分析该序列与其他基因的同源性。2.构建Mwg1的基因敲除菌株。根据Mwg1的基因组序列设计引物，从绿僵菌Ma102基因组DNA中扩增出Mwg1的左、右臂DNA片段，分别插入pMaDisrupter-3载体中Bar基因的5’端或3’端，构建Mwg1的敲除载体。采用农杆菌介导转化法获得转化子。通过PCR分析和Southern blotting验证获得了Mwg1的缺失菌株即Mwg1。3. Mwg1的基因功能分析。（1）Mwg1在绿僵菌抗逆生长中的作用：在加入CR、SDS、CFW等细胞壁干扰剂和加入KCl、山梨醇、甘露糖等渗透剂的PDA上培养Mwg1，用WT做对照，观察其菌落形态、菌丝在产孢量、生物量积累上的差异；将Mwg1、WT的孢子涂布在PDA培养基上，用紫外照射1-5h，于28°C培养24小时，统计分析其相对萌发率，比较两者之间是否存在差异；将Mwg1、WT的孢子用45°C水浴恒温箱孵育1-5h或65°C恒温培养箱放置2-8h，涂布在PDA培养基上，于28°C培养24小时，统计分析其相对萌发率，比较Mwg1与WT之间是否存在差异；（2）细胞壁多糖含量分析：将Mwg1、WT的菌丝细胞壁酸处理后，分别用3,5-DNS比色法测定总糖含量、NaCl-H3BO3溶液紫外分光光度比色法测定甘露聚糖含量、SLP比色法测定β-1,3-葡聚糖含量，分析其细胞壁多糖的组成变化。（3） Mwg1的毒力测定。分别将Mwg1和WT孢子悬液，采用体内注射和体表侵染两种途径感染东亚飞蝗，观察测定体内注射或体表侵染后蝗虫死亡时间，通过统计半数致死时间，分析Mwg1与WT对宿主蝗虫的毒力差异。主要研究结果：1．生物信息学分析结果显示Mwg1的基因中有1个内含子，Mwg1由406个氨基酸组成，其Mwg1蛋白分子量为41KD，等电点为5.22；Blast分析发现该基因与其它真菌的细胞壁转移酶基因有较高的同源性。2．成功构建了Mwg1的敲除载体；PCR分析和Southern blotting验证获得了两个Mwg1菌株。3．Mwg1的基因功能分析。（1）与WT相比，在含有刚果红的PDA培养基上， Mwg1明显生长缓慢，菌落直径偏小，显微观察发现Mwg1菌丝明显减少；在PDA含KCl等渗透剂的培养基上， Mwg1与WT的生长匀受到抑制，但两者之间没有显著差异；荧光显微镜观察Mwg1和WT的菌丝，发现Mwg1比WT菌丝分支显著减少、隔间长度显著增加；在加入SDS或CR的PDA培养基上， Mwg1比WT的产孢量显著下降，但孢子萌发率差异不显著；经紫外照射2-4h， Mwg1孢子萌发率显著高于WT；经45°C水浴或65°C干热处理后， Mwg1孢子萌发率与WT没有显著差异。（2）菌丝细胞壁总糖，甘露聚糖，葡聚糖的含量测定结果显示： Mwg1与WT相比，总糖和β-1,3-葡聚糖的含量显著降低，但甘露聚糖含量显著增加。（3） Mwg1与WT的毒力测定结果表明：体内注射或体表侵染处理后， Mwg1和WT的半致死时间无显著差异。主要结论：Mwg1影响绿僵菌细胞壁结构的形成，缺失Mwg1可引起绿僵菌细胞壁β-1,3-葡聚糖与甘露聚糖比例发生变化，使菌丝分隔减少、节间变长，但对绿僵菌的毒力不产生影响。绿僵菌细胞壁甘露聚糖比例的增加可能有增强绿僵菌抗紫外能力的作用。