乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染加剧罹患肝细胞肝癌等终末期肝脏疾病的风险,有效控制HBV感染是预防和治疗肝癌的关键。共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）是HBV转录的唯一模板,通过与病毒和宿主蛋白相互作用以微染色体的形式存在于细胞核,是慢乙肝难以治愈的根本原因。cccDNA的转录活性受宿主众多因素调控,其中cccDNA结合组蛋白的表观修饰在调控cccDNA的转录中发挥重要作用。同时,HBV编码的病毒蛋白,特别是HBx,还可以通过反式调控多种宿主因子的表达来维持自身复制。研究报道,长链非编码RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）能够通过表观调控参与多种病毒的复制过程,但lncRNAs能否表观调控HBV cccDNA转录,迄今尚不清楚。本论文旨在研究lncRNAs对HBV cccDNA的转录调控作用及其分子机制,并探讨HBV通过调控lncRNAs逃逸宿主抗病毒免疫的分子机制,以期为HBV治疗提供新的策略。为实现上述目的,论文利用HBV感染不同来源的肝细胞（正常肝细胞系HepaRGNTCP、肝癌细胞系HepG2NTCP、Huh7NTCP和HLCZ01细胞）以及HBV表达质粒pHBV1.3、pHBV1.1和MC-HBV转染的Huh7和HepG2细胞等细胞模型,同时借助尾静脉高压注射HBV表达质粒pAAV-HBV1.2构建的C57BL/6小鼠模型开展相关研究。主要研究方法及结果如下:第一部分组学筛选参与调控HBV复制的新lncRNAs一、组学筛选发现,HBV感染显著抑制肝细胞内LINC01431表达为明确HBV调控的lncRNAs,将HBV感染和未感染的HLCZ01细胞进行lncRNA测序。数据分析发现,在HBV感染的肝细胞中转录调控和RNA生物合成通路显著富集,其中有11个未注释的lncRNAs显著差异表达。在HBV感染及HBx过表达的肝细胞中检测发现,LINC01431是唯一被HBV和HBx共同抑制的lncRNA。进一步在多种HBV复制模型中证实,HBV通过HBx抑制LINC01431的转录。二、LINC01431 抑制 HBV cccDNA 转录为明确LINC01431对HBV复制的调控作用,我们在体内/体外多种HBV复制模型中过表达或敲低LINC01431,检测HBV复制相关指标。结果显示,LINC01431显著抑制HBV复制,表现为病毒抗原（HBsAg/HBeAg）、HBV RNAs和HBV-DNA水平降低,而cccDNA水平不变。进一步双荧光素酶报告实验发现,LINC01431抑制病毒不同启动子的转录活性。ChIP结果发现,LINC01431抑制cccDNA上激活型表观修饰水平。上述结果提示LINC01431可能通过表观调控抑制cccDNA转录及HBV复制。第二部分LINC01431通过与PRMT1结合抑制HBV cccDNA转录一、LINC01431主要定位于细胞核LncRNAs的亚细胞定位与其生物学功能密切相关。为明确LINC01431的亚细胞定位,进行核浆RNA分离实验以及RNA原位杂交（FISH）实验,发现LINC01431主要定位于细胞核中。二、PRMT1是LINC01431的互作蛋白为探究LINC01431抑制HBV cccDNA转录的分子机制,利用RNA pull-down实验结合质谱分析,发现PRMT1是LINC01431的潜在互作蛋白。RNA免疫沉淀实验（RIP）、RNA pull-down实验和免疫荧光实验（IFA）均证实PRMT1能够与LINC01431相互作用。进一步通过构建PRMT1的截短体结合RIP实验发现,PRMT1的178-265结构域是与LINC01431相互作用的关键区域。三、LINC01431抑制HBV cccDNA转录依赖于PRMT1为明确PRMT1是否参与LINC01431对HBV复制的抑制作用,在HBV感染的HepaRGNTCP和Huh7NTCP细胞中,过表达LINC01431的同时敲低PRMT1,检测HBV复制相关指标。结果显示,敲低PRMT1显著逆转LINC01431对HBV复制的抑制作用,并且PRMT1逆转LINC01431的抗病毒作用依赖于其甲基转移酶活性。综上,PRMT1介导LINC01431对HBV的转录抑制。第三部分LINC01431促进PRMT1介导的cccDNA H4R3me2a修饰及HBV转录抑制一、LINC01431增强PRMT1的蛋白稳定性1.LINC01431增强PRMT1的蛋白稳定性LncRNAs调控互作蛋白稳定性是其功能调控的重要方式。细胞转染及基因表达分析发现,过表达LINC01431可以剂量依赖性地促进PRMT1的蛋白表达,但不影响PRMT1的mRNA转录。蛋白稳定性分析发现,过表达LINC01431显著延长PRMT1蛋白的半衰期,敲低LINC01431加速PRMT1降解,提示LINC01431增强PRMT1的蛋白稳定性2.LINC01431抑制PRMT1蛋白的泛素化修饰泛素化修饰在调控蛋白稳定性中发挥重要作用,通过蛋白泛素化修饰实验发现,过表达LINC01431显著降低PRMT1蛋白的多聚泛素化水平,敲低LINC01431促进PRMT1的多聚泛素化修饰,证明LINC01431通过抑制PRMT1蛋白的多聚泛素化修饰增强PRMT1的蛋白稳定性。3.LINC01431抑制HBx介导的PRMT1泛素化降解已有文献报道HBx可以结合并促进PRMT1蛋白的泛素化降解。在HBV感染和HBx过表达模型中,利用免疫共沉淀实验（Co-IP）和泛素化修饰实验分析发现,LINC01431抑制HBx与PRMT1 178-265结构域的相互作用以及HBx介导的PRMT1泛素化修饰,提示LINC01431通过竞争性抑制HBx与PRMT1的相互作用抑制HBx对PRMT1的泛素化降解。二、LINC01431通过PRMT1表观调控cccDNA的转录抑制1.LINC01431 促进 PRMT1 和 H4R3me2a 在 cccDNA上的富集为进一步探究LINC01431能否影响PRMT1在HBV cccDNA上的富集,在多种HBV感染模型中过表达或敲低LINC01431。ChIP实验显示,LINC01431促进PRMT1及其已知修饰H4R3me2a在HBV cccDNA上的富集。2.LINC01431促进PRMT1介导的cccDNA转录抑制为探究LINC01431-PRMT1-H4R3me2a通路能否参与表观调控cccDNA转录,首先在多种HBV复制模型中干预LINC01431表达。ChIP实验发现LINC01431显著抑制Ac-H3、Ac-H4、H3K27ac、H4K8/K12ac 以及 RNAPolⅡ 在 cccDNA 上的富集。进一步在LINC01431过表达的同时敲低PRMT1或加入PRMT1抑制剂处理,ChIP结果表明,敲低PRMT1或PRMT1抑制剂处理显著拯救LINC01431引起的cccDNA上组蛋白乙酰化和RNA Pol Ⅱ富集水平的降低。综上,LINC01431通过PRMT1表观调控cccDNA的转录抑制。第四部分HBx通过转录抑制LINC01431逃逸宿主的抗病毒作用一、HBV通过HBx抑制LINC01431的转录为探究HBV抑制LINC01431转录的关键因子,分别过表达HBV的病毒蛋白,LINC01431启动子报告实验和转录水平检测发现,除Polymerase外,HBV及其各编码蛋白均不同程度的抑制LINC01431转录,其中HBx的抑制作用最为显著并且呈现剂量依赖性,说明HBx是HBV抑制LINC01431转录的关键病毒蛋白。二、转录因子ZHX2介导HBx对LINC01431的转录抑制为进一步解析HBx抑制LINC01431转录的分子机制,利用数据库预测LINC01431启动子区潜在转录因子结合位点并与HBx调控的转录因子相比较,发现ZHX2是潜在的调控因子。ChIP和RT-qPCR实验发现,ZHX2与LINC01431的启动子区域结合并促进LINC01431转录。进一步在HBx过表达的细胞中敲低ZHX2,发现敲低ZHX2显著拯救HBx对LINC01431的转录抑制作用,证实HBx抑制LINC01431转录依赖转录因子 ZHX2。研究结论及意义本研究鉴定了一个新的参与cccDNA转录调控的lncRNA,即LINC01431。LINC01431结合并稳定PRMT1蛋白,进而促进PRMT1在cccDNA上的富集,导致cccDNA结合组蛋白的甲基化及乙酰化修饰改变,抑制cccDNA的转录。另一方面,HBV通过HBx抑制LINC01431的转录促进自身复制。我们的研究揭示了 LINC01431介导宿主细胞与HBV cccDNA相互作用的新机制,为HBV治疗提供了新靶点。