论文部分内容阅读
目的:目前,心脑血管疾病发病率逐年升高,而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是众所周知的血管性疾病的重要病因,AS以富有脂质的斑块在大动脉壁聚集为特征,病理上可表现为血管内膜炎症细胞增殖,内皮功能障碍、管腔变窄及附壁血栓等。临床上常见的脑血管疾病,往往由AS为基础发展而来,在AS的血管壁病变的基础上,出现管腔狭窄、血流瘀滞、血栓形成,进而出现血管的闭塞或栓塞,出现脑部脑实质病变的相应症状及体征。目前,对AS发生机制的研究日益深入逐渐发现,血管内皮功能障碍可能是导致AS发生的重要始发事件之一。血管内皮细胞是位于血管内腔面的单层扁平细胞,是机体中一类非常重要的细胞群体,在血管通透性屏障、免疫防御和炎症反应中起着极为重要的作用。血管内皮细胞凋亡是AS发展的重要过程。一旦内皮细胞发生凋亡,血管内皮可能会失去调节脂质体内平衡及调节免疫和炎症的能力,继而导致脂质沉积,形成促进动脉斑块形成的环境。此外,管腔内不稳定斑块的出现可能也与血管内皮细胞的凋亡相关,斑块的脱落可能引起动脉到动脉的栓塞,导致急性冠状动脉堵塞和猝死。因此,调控血管内皮细胞凋亡是AS的潜在的预防和治疗途径。寻找血管内皮细胞凋亡的原因并探究其作用通路,对防治AS具有重要的理论价值及实践意义。细胞内氯离子通道蛋白4（Chloride Intracellular Channel4,CLIC4）又称为线粒体氯离子通道蛋白（Mitochondrial chloride channel protein,mt CLIC）,是细胞内氯通道蛋白（Cellular Chloride Channel Protein,CLIC）多种家族成员之一,分子量大小约为29KD。目前研究显示,其可以广泛表达于多种细胞中,包括肿瘤细胞、神经细胞及血管内皮细胞等,但其生物学功能尚不完全清楚。已报道的数据显示,CLIC4与多种细胞的凋亡相关,多种应激诱导剂均可导致CLIC4由细胞质转移到细胞核,核转位后启动细胞凋亡的发生。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）是在生理和病理生理过程中负调节人类基因的18-22核苷酸非编码RNA,与多种疾病的发生发展密切相关。有报导表明,miR-217水平与动脉硬化内皮功能损伤有关,该miRNA被鉴定为衰老的人脐带内皮细胞中最深层的调控miRNA。在Target Scan、micro RNA.org、mir DB三个网站中,预测可能调控靶基因CLIC4的micro RNA均指向miR-217,但二者是否存在确实的标靶关系,还需要进一步验证。内皮细胞凋亡在血管动脉粥样硬化的发病机制中起着至关重要的作用。miRNAs和Cl ICs已经被证实参与了内皮细胞凋亡的过程,但其潜在的分子机制尚不完全清楚。本研究的主要目的是研究microrna-217-5p（miR-217-5p）和CLIC4的生物学效应,二者对AS中内皮细胞凋亡的影响及其相关机制,同时确定内皮细胞凋亡过程中,miR-217-5p与CLIC4的相互作用关系。研究方法:1.将载脂蛋白E基因敲除小鼠高脂饮食（High fat diet,HFD）喂养12周,构建AS小鼠模型。取主动脉后,采用HE染色方法观测主动脉硬化组织病理改变,oil red O染色法观察AS脂质沉积情况,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的表达情况,western blot、免疫荧光检测细胞中CLIC4蛋白水平。将氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL;50μg/m L）作用于人主动脉内皮细胞24h,建立体外AS模型。通过实时荧光定量PCR检测miR-217-5p的表达情况,采用Western blot,免疫荧光检测方法检测CLIC4蛋白水平。2.研究miR-217-5p及CLIC4对ox-LDL处理的主动脉内皮细胞的影响。人主动脉内皮细胞内转染miR-217-5p minics上调miR-217-5p水平,采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平以验证转染效果。采用流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白水平,以及胞质和线粒体中细胞色素C的水平,JC-1法检测线粒体膜电位。细胞内转染CLIC4 siRNA下调CLIC4水平,Western blot检测细胞中CLIC4的水平,验证转染效果。流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、Bax、Bcl-2水平,以及胞质和线粒体中细胞色素C的水平,JC-1法检测线粒体膜电位。3.研究miR-217-5p与CLIC4的标靶关系。人主动脉内皮细胞内转染miR-217-5p minics后,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞模型中CLIC4水平;通过荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性;同时过表达细胞内miR-217-5p及CLIC4水平,通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9水平,观察CLIC4过表达后是否可以逆转miR-217-5p的作用。结果:1.经苏丹染色、HE染色、油红染色证实小鼠动脉硬化模型建立成功,小鼠主动脉内皮细胞中,HFD组miR-217-5p表达水平较正常饮食（Normal diet,ND）组显著减少,HFD组CLIC4蛋白表达水平显著增加。免疫荧光染色显示,在HFD组中CLIC4的表达显著上调;体外人主动脉硬化模型中,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平,ox-LDL组miR-217-5p的水平较对照组显著减少;Western blot及免疫荧光检测结果显示,ox-LDL组CLIC4水平较对照组显著增加。2.人主动脉内皮细胞转染miR-217-5p minics后,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平,与ox-LDL+NC组比较,ox-LDL+miR-217-5p mimics组细胞中miR-217-5p表达水平显著增加,证实转染成功;流式细胞术检测细胞凋亡情况,过表达miR-217-5p后ox-LDL+miR-217-5p mimics组较ox-LDL+NC组凋亡细胞比例减少;JC-1法检测线粒体膜电位,ox-LDL处理后,线粒体膜电位降低,而miR-217-5p过表达后线粒体膜电位得到恢复;Hoechst染色法检测细胞凋亡,ox-LDL处理后,凋亡细胞数明显增多,而转染miR-217-5p mimics后,凋亡细胞数减少;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况,结果显示,ox-LDL处理后,Bcl-2蛋白表达量显著降低,而Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量显著升高,miR-217-5p过表达可逆转这一变化;Western blot检测线粒体中细胞色素C的水平,ox-LDL组细胞线粒体中细胞色素C表达量与对照组相比降低,ox-LDL+miR-217-5p mimics组细胞线粒体中细胞色素C表达量较对照组显著增加。通过siRNA技术沉默人主动脉内皮中CLIC4基因的表达,随后,通过Hoechst染色法观察细胞凋亡情况。结果显示,ox-LDL处理后,凋亡细胞明显增多,而转染CLIC4 siRNA后,凋亡细胞数减少;同时,流式细胞术对细胞凋亡检测也发现,转染CLIC4 siRNA后较ox-LDL+NC siRNA组凋亡细胞比例减少;JC-1法检测线粒体膜电位结果显示,ox-LDL处理后,线粒体膜电位降低,而miR-217-5p过表达后线粒体膜电位得到恢复;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况,结果显示,ox-LDL处理后,Bcl-2蛋白表达量显著降低,而Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量显著升高,CLIC4 siRNA可逆转上述变化;Western blot检测线粒体中细胞色素C的水平,与ox-LDL+NC siRNA组比较,转染CLIC4 siRNA组细胞线粒体中细胞色素C表达量显著增加。3.实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞模型中CLIC4水平,ox-LDL处理后,与NC mimics组比较,miR-217-5p mimics组细胞中CLIC4 m RNA和蛋白的表达量均显著降低;荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性,miR-217mimics+CLIC4-wt组较NC mimics+CLIC4-wt和miR-217 mimics+CLCI4-mut组相比荧光素酶活性均显著下降;流式细胞术测定每组中的细胞凋亡,过表达miR-217-5p后ox-LDL+miR-217-5p mimics组较ox-LDL+NC组凋亡细胞比例减少,miR-217mimics+CLIC4-wt组显示凋亡细胞数较过表达miR-217-5p组增多。Wstern blot检测cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达水平,miR-217-5p过表达组较单纯ox-LDL处理组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量降低,miR-217 mimics+CLIC4-wt组较miR-217-5p过表达组上述凋亡相关蛋白水平升高,证实CLIC4过表达可逆转miR-217-5p的作用。结论:1.通过AS小鼠模型及体外实验证实,AS的主动脉内皮细胞中,miR-217-5p的表达降低,CLIC4的表达增加。2.CLIC4可以通过线粒体途径诱导主动脉内皮细胞的凋亡,而miR-217-5p过表达可以抑制线粒体途径诱导的主动脉内皮细胞凋亡。3.miR-217-5p能靶向结合CLIC4,miR-217-5p过表达可以降低CLIC4的表达,CLIC4过表达可逆转miR-217-5p的作用,二者呈负调控相关,共同调节线粒体途径诱导的主动脉内皮细胞凋亡。