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昆虫细胞色素P450（CYP）酶系在有毒物质的分解和代谢过程中发挥着重要作用,已有研究表明P450酶系可被杀虫剂、药物、化学物质等诱导。棉铃虫在取食植物时,CYP会受到次生物质的诱导表达并参与解毒代谢过程,CYP6B家族的表达在此过程中发挥重要作用,其过量表达会使棉铃虫对杀虫剂产生抗性。研究发现植物次生物质2-十三烷酮（2-TD）能够诱导棉铃虫六龄幼虫中肠内CYP6B6的过量表达,降低幼虫的重量和20E滴度,使棉铃虫的化蛹时间明显延长,处理10天后蛹的重量减少,同时棉铃虫的化蛹率和羽化率显著降低;而饲喂含有CYP6B6ds RNA的人工饲料能够降低CYP6B6的表达,减轻幼虫的重量,缩短幼虫的体长,阻碍幼虫蜕皮从而延长幼虫期,甚至引起幼虫死亡。这些结果表明CYP6B6参与了棉铃虫体内蜕皮激素和保幼激素的代谢通路。本文用10 mg/g 2-TD处理棉铃虫6龄幼虫不同时间后,结合酵母单杂交（Y1H）技术和转录组测序（RNA-seq）技术获得诱导CYP6B6表达的候选调控因子,并初步了解2-TD调控棉铃虫生长发育和代谢解毒的通路。利用大肠杆菌系统原核表达候选调控因子的融合蛋白,实时荧光定量PCR（q PCR）技术检测候选调控因子在棉铃虫幼虫期的时空表达规律。通过凝胶阻滞分析（EMSA）技术确定能与CYP6B6启动子中2-TD响应序列（HE1元件）结合的调控因子,测定各调控因子在2-TD胁迫或CYP6B6 ds RNA处理后的表达规律,并运用酵母双杂交（Y2H）技术鉴定各调控因子之间的相互作用。通过以上结果初步掌握2-TD处理后调控因子介导CYP6B6表达的通路,这为CYP6B6调控棉铃虫生长发育提供理论依据,并筛选影响棉铃虫生长发育的关键基因,为建立高效稳定环境友好的害虫控制方法奠定基础。1.Y1H技术筛选2-TD诱导CYP6B6表达的候选调控因子用10 mg/g 2-TD处理棉铃虫6龄幼虫,取不同时间（4 h、9 h、17 h、22 h、29h、33 h和41 h）的中肠组织建立混合c DNA文库,同时构建含有CYP6B6启动子2-TD响应序列的诱饵报告株通过Y1H从c DNA文库中筛选与诱饵报告株相互作用的蛋白因子。通过多次Ab A筛选后获得了29个与2-TD胁迫有关的阳性克隆,将这些酵母阳性克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,发现它们属于17个不同蛋白的序列。对这17个序列进行酵母诱饵报告株的转录激活验证,最终确定了6个蛋白是CYP6B6响应2-TD胁迫的候选调控因子,分别是磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）、脂多糖诱导肿瘤坏死因子的α因子（LITAFb）、真核翻译起始因子3亚基G（e IF3G）、乙醇脱氢酶5（ADH5c）、钙调宁蛋白（CAL）和气味受体蛋白（OR26）。2.RNA-seq技术明确2-TD胁迫后的代谢通路用10 mg/g的2-TD处理棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,取中肠组织分别建立c DNA文库,利用RNA-seq技术分析中肠内所有基因的表达模式,并从中获取响应2-TD胁迫的差异表达基因（DEGs）。处理6 h后共有380个DEGs（210个上调和170个下调）,处理15 h后共有314个DEGs（177个上调和137个下调）,其中包括一些与Y1H技术获得的候选调控因子相一致或相类似的DEGs,例如LITAF、e IF、ADH、脂肪酸结合蛋白（FABP）和FK506结合蛋白（FKBP）等。随后分析DEGs的分子功能、生物学过程和细胞组成,从而掌握响应2-TD胁迫的代谢通路和信号途径。DEGs显著富集于生物、代谢、氧化还原和细胞修饰氨基酸代谢过程,主要起催化活性、氧化还原酶活性、铁离子结合、亚铁血红素结合、四吡咯结合、乙酰辅酶A脱氢酶活性和转移己糖基团活性的分子功能,从而参与脂肪酸降解、细胞色素P450的外源物质代谢、昆虫激素合成、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解和谷胱甘肽代谢等通路,以及Jak-STAT、m TOR和Fox O和光传导-飞行等途径。同时,补充了4个CYP6B6响应2-TD胁迫的候选调控因子,即LITAFa、ADH5b、FABP1和叉头蛋白A（FOXA2）。3.候选调控因子的克隆、原核表达以及在棉铃虫体内的时空表达规律从10 mg/g 2-TD处理的棉铃虫6龄幼虫中肠c DNA中,获得各候选调控因子的核酸序列,并利用大肠杆菌系统表达候选调控因子的融合蛋白。通过q PCR技术检测棉铃虫幼虫期和6龄幼虫不同组织内各候选因子的表达量。结果显示PEBP、LITAFa、LITAFb、e IF3G、ADH5b、ADH5c、CAL、FABP1、FKBP12和FOXA2的开放阅读框（ORF）序列分别为588、342、237、837、1005、1005、564、405、327和669 bp,编码195、113、78、278、334、334、187、134、108和222个氨基酸。10个候选调控因子的时空表达规律结果显示,除Ha FOXA2以外的其它基因在幼虫的所有时期都表达,且在大龄幼虫和预蛹期中的表达量较高;除Ha LITAFa和Ha FOXA2以外的其余8个基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中都表达,且在脂肪体和中肠的表达量较高。4.EMSA技术获得能与CYP6B6启动子HE1元件结合的调控因子通过EMSA检测候选调控因子Ha PEBP、Ha LITAFa、Ha LITAFb、Hae IF3G、Ha ADH5b、Ha ADH5c、Ha CAL、Ha FABP1、Ha FKBP12和Ha FOXA2,是否与CYP6B6启动子HE1元件结合,从中明确真正的调控因子。其中有7个蛋白（Ha LITAFa、Ha LITAFb、Hae IF3G、Ha ADH5c、Ha CAL、Ha FKBP12和Ha FOXA2）能与HE1元件结合,因此它们是诱导CYP6B6表达的调控因子。随后通过2-TD胁迫和CYP6B6沉默来检测调控因子的表达规律,推测调控因子与CYP6B6启动子的结合方式。结果显示10 mg/g 2-TD处理不同时间后,CYP6B6、Ha LITAF和Ha FKBP三者的表达模式一致,都是在12 h达到最大值然后在48 h降低至最小值;Ha ADH5c和Ha CAL的表达规律一致,都是从6 h最大值降低至48 h最小值;而Hae IF3G和Ha FOXA2较为一致,都是在20 h内的表达量减少而在48 h的表达量显著高于对照;对10 mg/g 2-TD诱导后对各调控因子的表达量进行相关性分析,发现CYP6B6和Ha LITAF、Ha ADH5c和Ha CAL、Hae IF3G和Ha FOXA2都是高度正相关的,而Ha FKBP和Ha FOXA2是高度负相关的。CYP6B6沉默后除Ha FOXA2外,所有调控因子的表达量在处理48 h和72 h都显著低于对照;在对照组中检测不到Ha FOXA2的表达,且在处理组中只有少量的表达。以上结果表明调控因子Ha LITAF、Hae IF3G、Ha ADH5c、Ha CAL、Ha FKBP12和Ha FOXA2都能与CYP6B6启动子的HE1元件结合,调控CYP6B6的表达,从而参与棉铃虫体内细胞生长和发育的通路。5.Y2H技术确定调控因子之间的蛋白-蛋白相互作用将各调控因子（Ha LITAF、Hae IF3G、Ha ADH5c、Ha CAL、Ha FKBP和Ha FOXA2）的ORF连接至两种酵母表达载体p GBKT7和p GADT7上;将重组质粒p GBKT7-prey转化酵母Y2HGold菌株后,通过单缺培养基SDO/X检测各因子的自激活效果;将两种重组质粒共同转化酵母Y2HGold菌株,获得双杂交用重组菌Y2HGold（p GBKT7-prey）（p GADT7-prey）,通过两种缺陷培养基DDO/X和QDO/X/A验证重组菌的生长状况和显示情况。结果显示所有调控因子的Y2HGold（p GBKT7-prey）菌株在SDO/X培养基上都能正常生长,但只有Y2HGold（p GBKT7-Ha FOXA2）菌株呈现蓝色,表明除了Ha FOXA2以外的其他调控因子的ORF都不能单独激活酵母转录;在双杂交试验后只有3个菌株在DDO/X和QDO/X/A培养基上都能正常生长且显蓝色,即Y2HGold（p GBKT7-Ha PEBP）（p GADT7-Hae IF3G）、Y2HGold（p GBKT7-Ha LITAF）（p GADT7-Hae IF3G）和Y2HGold（p GBKT7-Hae IF3G）（p GADT7-Hae IF3G）,表明Ha PEBP-Hae IF3G、Ha LITAFb-Hae IF3G和Hae IF3G-Hae IF3G之间存在相互作用从而激活酵母转录,Ha PEBP可能作为辅激活因子参与2-TD诱导CYP6B6表达的过程。