北疆胡杨茎秆液及胡杨碱的微生物多样性分析和植物促生菌的筛选

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胡杨(Populus euphratica Olivier)是我国唯一一种能够在极端干旱的沙漠和半沙漠的环境中生长的多年生乔木植物,新疆胡杨林约占全国胡杨林总面积的90%。为了明确北疆不同分布地带的胡杨不同部位的细菌多样性和群落动态,分离胡杨内生菌和胡杨碱的细菌;从中筛选具有促生作用的,提高农作物生产的微生物资源,为应用植物促生菌改善作物生长打下基础。本研究以艾比湖湿地自然保护区和木垒原始胡杨林的胡杨作为采样目标,取胡杨茎秆液和树皮结疤上的胡杨碱用五种培养基(MA、TSB、BPA、PEA、R2A)、通过组织稀释培养法进行可培养细菌的分离与纯化,基于16S rRNA基因序列分析和系统发育分析、研究了艾比湖湿地自然保护区和木垒原始胡杨林胡杨茎秆液和胡杨碱细菌的多样性与群落结构;对分离到的潜在新种进行多项分类学鉴定;采用平皿对歭培养法结合催芽和盆栽方法对所分离菌的促生功能进行了评估和筛选,最后对三株细菌的促生作用进行了评价。主要研究结果如下:1.从艾比湖湿地自然保护区和木垒原始胡杨林的胡杨茎秆液和胡杨碱中分离得到258株胡杨内生菌、176株胡杨碱细菌,一共分离了434株菌株;其中木垒原始胡杨林内生菌有113株,胡杨碱细菌有109株;艾比湖湿地自然保护区胡杨林胡杨内生菌有145株,胡杨碱细菌有67株。2.16S rRNA基因序列系统发育分析表明,从木垒原始胡杨林胡杨内存液分离获得的113株细菌中23株菌属于Actinobacteria_c,占20.4%;49株菌属于Gammaproteobacteria,占43.4%;3株菌属于Alphaproteobacteria占2.6%;38株菌属于Firmicutes占33.6%;113株菌株可以分类为3个门,4纲,9目,17科,19属;其中芽孢杆菌属(Bacillus)的分离频率最高,而Brenneria salicis是优势物种,一共分离了22株。3.从木垒胡杨林胡杨碱分离的109株菌归类为Gammaproteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria_c等3个门、6目、8科、14属。其中属于Firmicutes Bacilli的细菌有74株,占67.8%,属于Gammaproteobacteria的细菌有6株,占5.5%。分离频率最高的属是Bacillus,一共45株菌株;其次的是Nesterenkonia属,有23株菌株。占优势的种是Bacillus zhangzhouensis和Nesterenkonia populi。4.从艾比湖胡杨林胡杨内存液分离的145株细菌归类为Gammaproteobacteria(占40%),Firmicutes Bacilli(占48%),Actinobacteria_c(占9.7%),Alphaproteobacteria(占1.4%),Betaproteobacteria(占0.7%)等5个类群、8目15科19属。占优势的属是Bacillus,有44株菌,其次是Halomonas,有41株菌。占优势种是Bacillus zhangzhouensis和Halomonas songnenensis。5.从艾比湖胡杨碱分离的67株细菌归类为四大类群,Gammaproteobacteria(占19.4%),Firmicutes Bacilli(占59%),Actinobacteria_c(占16.4%),Alphaproteobacteria(占4.5%),一共有6个目、8个科、10个属。占优势的属是Bacillus,占53%;占优势种是Bacillus zhangzhouensis占17.9%。6.培养基的分离效果:MA培养基分离到了144株、BPA培养基分离到了98株、PEA培养基分离到了71株、TSB培养基分离到了69株、R2A培养基分离到了52株;其中用MA培养基分离获得的菌最多,分离到的144株菌属于25个属,54个物种;然而,培养基优势度指数最高的培养基是R2A培养基,分离获得的52株菌株属于30个物种,优势度指数为0.576;添加胡杨树秆浸提液的PEA培养基的优势度指数仅次于R2A培养基,为0.408;7.总结从艾比湖湿地自然保护区胡杨林胡杨碱分离到的潜在新种MD2的多项分类学研究结果,我们建议菌株MD2T是Nesterenkonia属内新种,并命名为Nesterenkonia Ebinurense,(MD2T=KCTC52999T=MCCC1K03343T)。8.总结从木垒原始胡杨林胡杨茎秆液分离到的潜在新种PA5、TA6和TA22的多项分类学研究结果,认为这三株菌是同一个物种,并且是盐单胞菌属(Halomonas)的新物种,并命名为Halomonas populi,(TA22T=MCCC1K03439T=KCTC62169T)。9.采用平皿对歭培养法、通过特异性培养基进行筛选获得158株有植物促生潜力的功能菌。其中61株菌株有解磷能力,80株菌有溶解钾能力,32株菌有固氮能力,151株菌有利用铁氨盐能力。对玉米种子进行催芽和盆栽研究发现菌株BB33-1、TC10和RC6的发芽率、幼苗株高、幼苗干重都显著大于对照组。10.对玉米种子进行催芽和盆栽研究发现菌株BB33-1、TC10和RC6的发芽率、幼苗株高、幼苗干重都显著大于对照组。(1)菌株BB33-1有解磷和固氮能力,跟芽孢杆菌属的Bacillus zhangzhouensis DW5-4T序列相似性为99.93%,革兰氏染色为阳性,菌落呈黄色,生长温度范围为8-45℃,盐浓度范围是0-12%, pH范围是5-11。(2)菌株TC10有解磷和利用铁氨盐能力,跟盐单孢菌属的Halomonas olivaria C17_DQ645593T序列相似性为98.39%,革兰氏染色为阴性,有鞭毛的,形成暗黄色,不透明的单菌落。其生长范围是:4℃-50℃,盐浓度范围是:0-25%, pH范围是:5-10。(3)菌株RC6有解钾和固氮能力,跟芽孢杆菌属的Bacillus siamensis KCTC 13613T序列相似性为99.93%,革兰氏染色为阳性,有鞭毛,在LB培养基上生成半透明,黏液装,奶白色菌落。其生长范围是:4℃-55℃, pH范围是:4.5-9,盐浓度范围是:0-14%。
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