【摘 要】
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纤维素是世界上最丰富的可再生资源,因其结构复杂很难被微生物直接利用,导致纤维素的生物降解始终难以满足工业化生产的需求。生孢噬纤维菌是在土壤中非常常见的好氧性纤维素分解滑动细菌,它可以吸附在纤维素底物上生长并快速滑动,对纤维素有很强的降解能力。关于生孢噬纤维菌降解纤维素的机理还没有被阐明,也从未报道过来源于生孢噬纤维菌的β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶是木质纤维素生物降解途径中的关键酶,是商品化纤维素
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纤维素是世界上最丰富的可再生资源,因其结构复杂很难被微生物直接利用,导致纤维素的生物降解始终难以满足工业化生产的需求。生孢噬纤维菌是在土壤中非常常见的好氧性纤维素分解滑动细菌,它可以吸附在纤维素底物上生长并快速滑动,对纤维素有很强的降解能力。关于生孢噬纤维菌降解纤维素的机理还没有被阐明,也从未报道过来源于生孢噬纤维菌的β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶是木质纤维素生物降解途径中的关键酶,是商品化纤维素酶制剂的重要组成部分。为了挖掘和开发新型β-葡萄糖苷酶,本文从生孢噬纤维菌CX11的基因组中克隆了7个β-葡萄糖苷酶基因（Sm＿0148、Sm＿0268、Sm＿0864、Sm＿3000、Sm＿3799、Sm＿4302和Sm＿5379）,并分别在大肠杆菌中进行异源表达。经过亲和层析纯化后,获得了6个电泳纯的重组蛋白:Sm＿0268、Sm＿0864、Sm＿3000、Sm＿3799、Sm＿4302和Sm＿5379（Sm＿0148由于表达量太低,无法纯化）,它们的分子大小分别为81.7、108.4、83.5、81.9、81.2和82.1 k Da。对上述酶蛋白的最适反应温度和p H进行测定,结果表明Sm＿0268、Sm＿3000和Sm＿5379的最适反应温度为50 oC,而Sm＿0864、Sm＿3799和Sm＿4302的最适反应温度为45 oC。其中,Sm＿3000在温度达到60 oC时仍能保留40%以上的活性,具有一定的高温催化能力。除Sm＿5379外（最适反应p H 7.0）,其余5个β-葡萄糖苷酶的最适反应p H均为7.5。在最适反应条件下对重组蛋白Sm＿0268、Sm＿0864、Sm＿3000、Sm＿3799、Sm＿4302和Sm＿5379进行酶活力测定,酶活力大小分别为（24.2±0.4）、（125.9±0.6）、（32.4±0.6）、（38.8±0.8）、（120.9±1.6）和（76.1±0.5）U/g。利用实时荧光定量PCR技术对上述酶蛋白的编码基因在生孢噬纤维菌CX11中的相对表达水平进行了分析,在以纤维二糖为唯一碳源培养时,所有β-葡萄糖苷酶基因的表达水平较之在以葡萄糖为碳源培养时均为上调,推测它们均不同程度参与了CX11降解纤维素的过程,其中Sm＿3799和Sm＿4302可能在CX11降解纤维素的过程中发挥关键作用。Sm＿3799和Sm＿4302热稳定性较差,具有较高的Na Cl和葡萄糖耐受性。Sm＿3799的Km为0.52 mmol/L,催化效率kcat/Km为422（mmol/L）-1s-1。与Sm＿3799相比,Sm＿4302的底物亲和力和催化效率均相对较高(Km为0.36 mmol/L,kcat/Km为537（mmol/L）-1s-1)。本论文首次将生孢噬纤维菌CX11来源的β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中进行了异源表达,并对重组蛋白的酶学性质进行了表征,构建了生孢噬纤维菌CX11的β-葡萄糖苷酶酶库,为挖掘新型β-葡萄糖苷酶及其功能应用奠定了基础。
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