论文部分内容阅读
基因工程疫苗制备技术被誉为疫苗史的第三次革命,其中研究最为广泛、深入的就是重组活载体疫苗。应用重组活载体疫苗在宿主体内表达外源蛋白引发机体的免疫保护反应是预防医学研究的重要方向之一。Invitrogen公司开发的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是最为方便、快捷,应用最广的杆状病毒表达系统。虽然杆状病毒在介导外源基因的表达、基因治疗、组织工程等有多种优势,是一种较为理想的工具,但是杆状病毒的介导的外源基因表达量与工业化大生产的要求有较大差距。并且持续表达的时间较短,转导效率低等。这些因素都限制了杆状病毒表达系统的应用。因此,杆状病毒的研究的重点就在于将外源基因表达时间延长,表达效率、转导效率提高。本课题就是从pFastBac[pH-]出发构建两出个重组杆状病毒转移载体pWK和pWK-ITR。即在pH启动子下经酶切添加水泡性口炎(vesicular stomatitis virus)的表面糖蛋白G蛋白,使杆状病毒假型化,进而增加杆状病毒的转导效率以及在动物体内的抗补体中和效应;在EF1α表达盒的目的基因3’UTR添加土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus)转录后调控元件(post-transcriptional regulatory element)简称WPRE,可以增加外源基因表达效率,将上述所构建出的质粒命名为pWK;腺伴随病毒末端反向重复序列adeno-associated virus(AAV) inverted terminal repeats (ITRs)长度为145bp,将它置于目的基因表达盒的两侧可以使表达的时间增长,因此本实验在EF1α表达盒的两侧通过酶切添加了ITRs,并将上述质粒命名为pWK-ITR。以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因为报告基因插入EF1α启动子的下游,构建重组转移载体pWK-EGFP和pWK-ITR- EGFP以及阴性对照pWK (-)-EGFP。使其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,提取重组Bacmid DNA后转染Sf9细胞,获得含有EF1α-EGFP表达盒的重组杆状病毒分别命名为BV-WK1、BV-WK2、BV-WK3。空斑分析法测定P3代重组杆状病毒滴度为1.23×108 pfu/mL、1.04×108 pfu/mL、1.32×108pfu/mL。以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为40的重组杆状病毒侵染OL细胞。试试验证明,经VSV-GED假型化的杆状病毒BV-WK1,BV-WK2转导OL细胞的时间明显缩短,比阴性对照BV-WK3减少了24小时,并且表达EGFP的阳性细胞率分别为57.3%、69.1%,明显高于阴性对照32.6%。含有ITRs的病毒BV-WK2能够有效的延长EGFP的表达时间,比对照BV-WK1增加了72小时。在倒置荧光显微镜视野下可观察到BV-WK1,BV-WK2的表达强度明显高于阴性对照BV-WK3。本试验证明了VSV-GED能够有效提高转导效率,WPRE能够显著增强外源基因的表达效率,ITRs延长外源基因表达的持续时间。本试验基本达到了预期的目的,为探究改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研发奠定了基础。