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我国豆粕资源不足,开发和利用非常规蛋白饲料资源十分迫切。黄酒糟作为黄酒产业的副产品,有较高的蛋白含量及低廉的价格,但由于新鲜黄酒糟含水量高难以保存,且有酒精残留不能直接饲喂动物,其氨基酸组成也不平衡。为此,本研究通过微生物固态发酵以提高黄酒糟的饲用价值,探索其在奶牛日粮中的应用效果。首先通过菌株组合、混菌固态发酵和发酵条件优化,提高黄酒糟蛋白含量和改善其氨基酸组成;在体外瘤胃发酵试验以及抗氧化性评价基础上,通过奶牛饲养试验探讨了发酵黄酒糟部分替代豆粕对奶牛生产性能、氮利用的影响,为非常规蛋白质饲料的利用提供理论依据和技术支持。1基于微生物的固态发酵黄酒糟工艺优化将待用的芽孢杆菌和酵母进行全基因组重测序,通过KEGG通路富集分析有关代谢基因发现,与参照芽孢杆菌和酵母菌相比,本研究待用的芽孢杆菌其氨基酸合成与代谢通路富集多,酵母菌在碳水化合物代谢以及氨基酸合成与代谢通路富集多,提示它们能在固态发酵中提升发酵饲料的营养和饲用价值。随后分别将酵母、芽孢单菌及联合发酵,发现联合混菌发酵具有较大优势。在微生物固态发酵工艺中,对菌种接种比例、发酵温度、培养基含水量、发酵时间、翻料次数等发酵条件进行单因素试验优化,挑选对发酵影响较大的发酵温度、培养基含水量以及菌种接种比例三个因素进行3X3正交设计,以优化发酵条件以获得最佳粗蛋白和多肽的产量。最佳条件如下:水与总固体培养基的比例为53:100(v/w),温度为30℃,严朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌的接种比例为2:1,发酵时间为44小时,翻料次数为2次。发酵黄酒糟饲料中粗蛋白、多肽含量分别比未发酵的高 14.5%、40.9%。2发酵黄酒糟营养价值及抗氧化特性的体外研究2.1营养成分分析通过对比发酵前后的养分变化发现,发酵黄酒糟氨基酸含量比未发酵黄酒糟提高26.1%,必需氨基酸增加量(31.2%)大于非必需氨基酸增加量(21.1%),特别是赖氨酸和蛋氨酸水平提升较多。同时,体外发酵试验表明发酵黄酒糟可增加瘤胃液微生物蛋白的浓度,提高粗蛋白消化率。2.2抗氧化性研究比较发酵前后的黄酒糟,发现发酵黄酒糟显著提高还原能力、DPPH自由基清除能力、还原力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力等;相关性分析表明,发酵黄酒糟抗氧化性能的增加与多酚类物质转化的增强以及小分子蛋白和多肽产生有关。通过2D蛋白电泳分离鉴定部分小分子蛋白,发现黄酒糟固态发酵过程中产生了蛋白酶以及生物活性物质,部分解析了发酵黄酒糟抗氧化能力提高的机制。2.3黄酒糟替代豆粕对瘤胃发酵的影响通过体外瘤胃产气试验探索不同比例的黄酒糟、发酵黄酒糟替代豆粕对瘤胃产气和发酵参数以及饲料间组合效应的影响,发现了最适的黄酒糟和发酵黄酒糟替代豆粕的比例,即当黄酒糟或者发酵黄酒糟在与豆粕1:1时,瘤胃发酵参数与以豆粕为主要蛋白源的对照组相近,且具有较强的正组合效应。3黄酒糟在奶牛日粮中的效果研究通过奶牛饲养试验,探究黄酒糟和发酵黄酒糟替代泌乳奶牛日粮中的部分豆粕对奶牛生产性能、瘤胃发酵、氮利用率以及热应激耐受力的影响。选取15头处于泌乳中后期的中国荷斯坦奶牛(泌乳天数190±15.2d,体重692±70kg)用于3X3复拉丁方试验。三种日粮处理为(干物质基础):(1)含18%豆粕日粮(对照组),(2)未发酵黄酒糟按日粮粗蛋白50%替代豆粕日粮(未发酵组),(3)发酵黄酒糟按日粮粗蛋白50%替代豆粕日粮(发酵组);每期试验期持续20天,前15天为适应期,后5天用为采样期。3.1奶牛生产性能和血液生化参数对照组和发酵组的干物质采食量高于未发酵组(P= 0.04),前两组组间无差异(P>0.05)。与对照组和发酵组相比,未发酵组产奶量(P=0.02)、乳蛋白(P=0.02)和能量校正乳(P= 0.05)产量均较低。在三种日粮中,未发现乳脂,乳蛋白,乳糖和总固形物含量存在差异(P>0.05);乳中尿素氮、体细胞数、饲料转化效率和氮转化率也没有日粮间的差异(P>0.05)。发酵组的售奶净收益较高于对照组和未发酵组(P= 0.06),而未发酵组与对照组间无差异(P>0.05)。未发酵组的血尿氮浓度低于发酵组和对照组(P=0.02),其他血液生化无组间差异(P>0.05)。3.2奶牛瘤胃发酵、日粮降解率及氮代谢未发酵组的瘤胃液总挥发性脂肪酸、乙酸、微生物蛋白浓度显著低于对照组(P<0.05),而对照组与发酵组间无差异(P>0.05);日粮处理没有改变瘤胃发酵模式(P>0.05)。日粮蛋白质的瘤胃快速降解部分(P=0.38)和慢速降解部分(P= 0.58)不受日粮影响;与对照组和发酵组相比,未发酵组的粗蛋白降解速率常数(P二0.04)和可消化部分(P=0.05)较低,而对照组与发酵组间没有差异(P>0.05)。与未发酵组相比,饲喂发酵黄酒糟和豆粕日粮的奶牛氮摄入量和瘤胃有机物降解率较高,奶牛的微生物蛋白和代谢蛋白产量增加,产奶性能得以改善。总体看,用发酵黄酒糟部分替代豆粕对泌乳奶牛的氮利用与代谢没有不利影响。3.3黄酒糟替代豆粕对奶牛热应激的影响饲喂未发酵和发酵黄酒糟日粮有降低热应激下奶牛直肠温度(P=0.06)和呼吸频率(P = 0.05)的趋势,并提高奶牛血液超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物以及总抗氧化能力水平(P<0.05);相比未发酵黄酒糟,饲喂发酵黄酒糟提高奶牛抗氧化的能力更强。通过分析奶牛血常规,发现未发酵和发酵黄酒糟在热应激下降低奶牛炎症细胞(白细胞、中性粒细胞)数量,提示热应激下能降低奶牛炎症的风险。综上所述,本研究通过枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌混菌联合固态发酵,制得了蛋白质和氨基酸含量较高、并具有抗氧化活性的发酵黄酒糟。结合体外试验和奶牛饲养试验的效果表明,发酵黄酒糟替代奶牛日粮中的部分豆粕并不影响奶牛生产性能,对奶牛瘤胃发酵和氮利用效率无不良影响,但能降低饲料成本,且能够缓解奶牛热应激。