卵巢癌是严重威胁广大妇女的恶疾,由于发病部位隐匿,早期症状不明显,卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤之首,70%~80%卵巢癌患者发现时已为晚期,五年生存率仅20%,而早期患者5年生存率可达70%~90%,所以提高卵巢癌早期诊断水平对提高其治愈率有重要意义,这也是目前妇科肿瘤研究关注的热点。肿瘤标志物的检测简便且无创,在肿瘤的筛查、诊断、指导治疗、预后评价等方面有着非常广泛的应用前景。目前只有癌抗原125(cancer antigen 125, CA125)检测被广泛应用于临床卵巢癌的诊断,大量研究证实CA125敏感性和特异性不高,对卵巢癌早期诊断率低。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4, HE4)是一种新的卵巢癌肿瘤标志物,最初是在人附睾上皮中发现的,可能有蛋白酶抑制剂的作用,但具体功能不详。HE4在卵巢癌组织中高表达,而在正常组织中不表达或低表达,在卵巢癌诊断方面其灵敏度要明显高于CA125,且能更好区分良性与恶性肿瘤,大量研究证实HE4是检测早期卵巢癌的最佳标志物之一。因此制备针对HE4的卵巢癌早期诊断试剂,对于提高卵巢癌患者的生存率有重要意义。传统的抗体制备方法通常采用纯化的蛋白质来免疫动物,但分离纯化蛋白费时费力,难以获得理想产品,有时即使获得了目的蛋白,其免疫原性也很低(如某些原核表达蛋白),难以获得理想的免疫效果。电穿孔辅助DNA免疫能克服上述缺点。瞬时电场可使细胞生物膜产生可恢复的微孔,外源基因在电场力的作用下通过微孔进入目标组织或器官,并在该组织或器官中直接表达目的抗原,引发免疫反应。DNA被细胞摄取后,基因半衰期延长,可持续表达目的蛋白,增强了淋巴细胞记忆持久性;另外,电穿孔引起局部组织炎症反应,使大量炎症细胞浸润,提高了抗原递呈效率,因此,电穿孔辅助DNA免疫能获得高效价的抗体。本研究利用RT-PCR从患者卵巢癌组织中获取HE4基因编码序列,通过T-A克隆将HE4基因克隆到pMD19T载体中,经测序鉴定后将其亚克隆至pPICZαA和pcDNA3.1(+)表达载体中,并通过PCR、双酶切及测序对其进行鉴定。将构建好的pPICZαA-HE4表达质粒通过电穿孔转染毕赤酵母GS115,在选择培养基上筛选阳性表达菌株,诱导其表达HE4重组蛋白,进一步通过ELISA、Western-blot鉴定表达的HE4重组蛋白。通过考察不同甲醇浓度、pH、诱导时间、生物量及诱导温度对HE4表达水平的影响,优化了HE4诱导表达的条件。对含HE4重组蛋白的酵母培养上清采用镍亲和层析进行纯化。另一方面,我们采用活体电穿孔法辅助pPICZαA-HE4和pcDNA3.1-HE4分别免疫BALB/c小鼠,通过B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合来制备单抗,经多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人HE4 mAb的杂交瘤细胞株。采用Western-blot,Ig亚型分析和mAb表位分析等对mAb的生物学特性进行鉴定。研究结果显示,成功从卵巢癌组织中获取了HE4基因,并构建了pcDNA3.1-HE4和pPICZαA-HE4两个真核表达载体;构建的毕赤酵母能分泌表达HE4蛋白,表达的重组蛋白已被糖基化修饰并具有一定的空间构象;HE4重组蛋白的最佳诱导条件为:pH4.0,2%甲醇,2倍菌量,温度26℃,诱导12h;从1L培养上清中,可纯化出约10mg的HE4重组蛋白;单抗制备方面,获得了2株持续、稳定分泌鼠抗人HE4 mAb的杂交瘤细胞株,命名为1-7-C和3-12-C,两株单抗培养上清抗体效价分别为1:160和1:320,ELISA和Western-blot结果均显示:本实验获得的两株mAb能够特异识别有天然构象的HE4蛋白,针对HE4蛋白的相同表位,两株mAb的Ig亚类均为IgM,轻链均为λ链。上述结果表明,HE4基因被成功克隆至pcDNA3.1-HE4和pPICZαA-HE4两个真核表达载体中;成功构建了表达HE4蛋白的酵母工程菌,获得了有空间构象的HE4重组蛋白,并获得2株分泌鼠抗人HE4 mAb的杂交瘤细胞株,为卵巢癌早期诊断和HE4蛋白功能研究奠定了基础。