猪肉是日常生活中重要的肉食品之一,含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和钙、磷等元素。猪肉内脂肪含量是影响它多汁性、风味和嫩度的重要因素。肌肉内脂肪以肌内脂肪组织、肌间脂肪组织和肌细胞内脂质三种形式存在。肌内脂肪含量主要由肌内脂肪细胞的数量和大小决定。肌内脂肪细胞的发育受到肥胖,饮食,衰老,性别等多种因素的影响,而肌细胞的脂质沉积含量与脂肪组织肥大和脂肪酸摄入的增多等有关。脂肪组织除了储存能量和释放游离脂肪酸外,还作为内分泌器官分泌瘦素,脂联素等多种具有生物活性的脂肪因子。近年来,脂肪组织分泌的外泌体被看作一种新的脂肪因子。外泌体是一类由细胞分泌到外环境和体液中的直径为40-160nm的细胞外囊泡,其内包含多种功能性RNA,蛋白和脂质等,可以被靶细胞吸收进而调控靶细胞的多种生物学过程。脂肪组织来源的外泌体可以介导脂肪组织内部脂肪细胞与巨噬细胞之间的细胞间通讯,也可以进入血液循环进而影响肝脏和骨骼肌等器官的胰岛素敏感性。然而,肌内脂肪细胞作为调控肌内脂肪含量的一类重要的细胞群,目前对它分泌的外泌体成分和功能尚不清楚。本研究通过体外分离培养肌内前体脂肪细胞并诱导其分化,并通过超速离心法和聚乙二醇(PEG)沉淀法分离细胞培养上清中外泌体。通过转录组测序手段构建了猪肌内前体脂肪细胞和肌内成熟脂肪细胞外泌体的cDNA文库。对测序数据进行过滤和质控后,筛选了差异表达的非编码RNA(sRNA和lncRNA)和信使RNA(mRNA),结合数据库比对和生物信息学分析预测了猪肌内前体脂肪细胞和肌内成熟脂肪细胞外泌体内非编码RNA的吸附关系、靶基因的GO和KEGG富集分析以及mRNA的通路富集情况和功能。此外,通过外泌体与肌细胞的共培养,探究了肌内前体脂肪细胞和肌内成熟脂肪细胞外泌体对肌细胞脂质沉积的影响。获得的主要研究结果如下:1.利用超速离心和PEG沉淀法分离肌内前体脂肪细胞和肌内成熟脂肪细胞培养上清外泌体。使用透射电镜分析、纳米粒径分析和外泌体标记蛋白WB的方法鉴定出两种细胞的外泌体。此外,通过比较,超速离心法分离的外泌体纯度更好,蛋白质污染较少。2.经sRNA注释和分类,肌内前体脂肪细胞外泌体miRNAs占sRNA的0.06%,肌内成熟脂肪细胞miRNAs占sRNA总量的0.11%。共检测到99个miRNAs,有13个差异表达,包含5个上调,8个下调的miRNAs。差异miRNAs的靶基因可能影响RNA的转录和蛋白质的磷酸化,参与生长发育和代谢的调控。3.经测序分析,两类细胞外泌体内共检测到32个差异表达的lncRNAs,肌内成熟脂肪细胞与肌内前体脂肪细胞相比有28个上调,4个下调,其中包含23个已知的和9个新鉴定的lncRNAs。构建了lncRNA与可能吸附的miRNAs的网络互作图,lncRNA靶基因可能参与调控细胞的生长发育和糖脂代谢等过程。4.肌内前体脂肪细胞和肌内成熟脂肪细胞外泌体内共检测到3249个mRNAs,其中包含860个差异表达的mRNAs,后者与前者相比有787个上调,73个下调。对mRNAs的KEGG和GO富集分析发现它们主要参与蛋白质的翻译过程,并与自噬、脂代谢等通路有关。5.肌内成熟脂肪细胞分泌的外泌体与肌内前体脂肪细胞的外泌体相比能够显著促进肌细胞的脂质沉积,促进肌细胞内脂质合成基因蛋白的表达。综上所述,本研究分离鉴定出了猪肌内前体脂肪细胞和肌内成熟脂肪细胞的外泌体,通过转录组测序检测两类细胞外泌体内RNA的表达谱变化。发现差异表达的外泌体RNA可能参与转录和蛋白质翻译等过程,并与脂质代谢相关。此外发现猪肌内成熟脂肪细胞的外泌体可以显著促进肌细胞的脂质沉积。本研究对探究猪肌内脂肪细胞外泌体的功能及其与肌细胞的细胞间通讯具有重要意义。