【摘 要】
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真菌次生代谢产物是一类具有广泛生物活性、结构多样的化合物,它们在保护人类健康和农林业保护方面发挥着重要作用。为探究紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)基因组中非核糖体肽类基因簇的合成代谢产物潜力,构建真菌异源表达体系。本论文选择两个可能不表达或弱表达的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇,进行大片段基因的克隆,构建异源表达载体;然后将重组载体导入到尿苷、尿嘧啶营养缺陷型
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真菌次生代谢产物是一类具有广泛生物活性、结构多样的化合物,它们在保护人类健康和农林业保护方面发挥着重要作用。为探究紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)基因组中非核糖体肽类基因簇的合成代谢产物潜力,构建真菌异源表达体系。本论文选择两个可能不表达或弱表达的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇,进行大片段基因的克隆,构建异源表达载体;然后将重组载体导入到尿苷、尿嘧啶营养缺陷型的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)菌株A1145中表达,对其产生化合物进行检测分析以及分离纯化。研究结果如下:1.选取6.1和11.1两个NRPS类基因簇,应用Red/ET同源重组系统,与真菌人工染色体FAC重组,分别构建p YUZ251和p YUZ254两个表达载体;为了提高转化子表达效率和筛选效率,在表达载体pyr G元件前插入诱导型启动子gla A;同时添加潮霉素抗性筛选标记,获得表达载体p YUZ252(68 kb)和p YUZ255(82 kb)。2.为增加差异离子峰数量和表达丰度,选择表达载体p YUZ252进行增强表达,在6.1基因簇核心基因PKS-NRPS前端,插入组成型启动子gpd A,构建增强表达载体p YUZ253(70 kb)。通过PEG-Ca Cl2介导原生质体转化,将其导入到构巢曲霉中,结合培养基筛选和潮霉素抗性筛选,获得4个阳性转化子。3.通过UPLC-MS检测,对这4个异源表达菌株的发酵产物分析,以构巢曲霉宿主和空载菌株的发酵产物为对照,发现异源表达菌株产生几个特异准分子离子峰m/z:395、659、742、734、1109和1135;经多次发酵分析,其中3个准分子离子峰m/z:734、1109和1135稳定存在。通过培养基筛选,发现异源表达菌株在PDA中生长不好;在YAG固体培养基中,则检测不到差异峰存在;在YAG液体和YAGs中,均能检测到差异离子峰,而在YAGs中产物丰度高一些。4.将pYUZ253表达菌株放大发酵,摇床培养14 d获得粗提物4.5 g。结合TLC和UPLC-MS,对目标分子离子峰进行分离纯化。
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